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細(xì)菌質(zhì)粒的制備（:堿裂解法、煮沸法和小量一步提取法）
最近更新時(shí)間：2015-11-10
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質(zhì)粒是染色體外的能獨(dú)立遺傳的共價(jià)閉合雙鏈DNA分子，它存在于細(xì)菌和其它一些生物體內(nèi)，能夠提供給宿主細(xì)胞一些表型如抗藥性，分解復(fù)雜有機(jī)物的能力。野生質(zhì)粒經(jīng)過改造后可以作為基因工程的載體，這種質(zhì)粒載體在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。因此質(zhì)粒的分離與提取是分子生物學(xué)zui常用、zui基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。
細(xì)菌質(zhì)粒是zui常用的基因工程載體，它的提取可以分為以下三步：細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，細(xì)菌的收集和裂解，質(zhì)粒DNA的純化。細(xì)菌培養(yǎng)物是通過在含有適當(dāng)濃度的抗生素的液體培養(yǎng)基中接種一含有所提質(zhì)粒的宿主菌的單菌落，37℃,150-250rpm搖培獲得的。對(duì)松弛型的質(zhì)粒，可以在細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)后期加入氯霉素抑制宿主菌蛋白的合成和染色體dna的復(fù)制來增加拷貝數(shù)。但目前所用的質(zhì)粒載體如pUC系列，采用強(qiáng)的改進(jìn)型的pMB1復(fù)制子，拷貝數(shù)能達(dá)到幾百個(gè)，因此不用進(jìn)行后期的氯霉素處理即可獲得高產(chǎn)量的質(zhì)粒。細(xì)菌的收集可以采用離心的方法，為了防止細(xì)菌排除的代謝廢物影響質(zhì)粒的純度可以用液體培養(yǎng)基或生理鹽水洗1-2次。細(xì)胞裂解的方法很多，如去污劑法，煮沸法，堿變性法等。這些方法各有利弊，要根據(jù)質(zhì)粒的性質(zhì)，宿主菌的特性及后續(xù)的純化方法等多種因素加以選擇。粗提質(zhì)粒為了滿足一些實(shí)驗(yàn)的要求還需要進(jìn)一步純化， 氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA是可靠經(jīng)典的方法。
細(xì)菌質(zhì)粒的提取常采用堿裂解法，煮沸法，一步提取法以及在堿裂解法基礎(chǔ)上的試劑盒法等。
堿裂解法利用宿主菌線狀染色體DNA與閉環(huán)雙鏈質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)狀態(tài)的差異來提取質(zhì)粒DNA。當(dāng)同時(shí)堿變性時(shí)，線狀基因組DNA變性充分而質(zhì)粒DNA處于拓?fù)淅p繞的自然狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)時(shí)（酸中和），質(zhì)粒DNA迅速準(zhǔn)確配置重新形成*天然超螺旋分子，而線狀DNA則與破裂的細(xì)胞壁，細(xì)菌蛋白相互纏繞成大型復(fù)合物，被SDS包蓋。當(dāng)K+取代Na+時(shí)這些復(fù)合物會(huì)從溶液中沉淀下來，附在細(xì)胞碎片上一起被離心除去。
煮沸法利用高溫破壞細(xì)菌細(xì)胞，同時(shí)利用溶菌酶酶解細(xì)菌細(xì)胞。把細(xì)菌懸浮于含有Triton X－100、溶菌酶（消化細(xì)胞壁）的緩沖液中，然后加熱到100℃，使其裂解。加熱破壞了細(xì)胞壁，還有助于解開DNA鏈的堿基對(duì)，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是閉環(huán)質(zhì)粒dna配對(duì)雖被破壞，但是鏈彼此不會(huì)分離，當(dāng)溫度下降恢復(fù)成超螺旋。離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì)，從上清液中回收質(zhì)粒DNA。小量一步提取法是直接將細(xì)菌培養(yǎng)物和酚/氯仿混合，同時(shí)完成細(xì)胞裂解、蛋白變性兩個(gè)過程，然后離心除去大部分細(xì)胞核DNA與蛋白質(zhì)，含質(zhì)粒DNA的上清用異丙醇沉淀。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)，特別適合大量質(zhì)粒的快速分析。
多數(shù)公司生產(chǎn)的商品化的質(zhì)粒提取試劑盒多采用在堿裂解法的基礎(chǔ)上通過特殊的吸附柱來純化質(zhì)粒DNA 的方法。經(jīng)堿裂解獲得的含質(zhì)粒的上清液和高鹽的結(jié)合緩沖液混合后，加到能、專一吸附DNA的特殊硅基質(zhì)填充的離心吸附柱子中，再用洗滌緩沖液通過離心洗去蛋白、鹽等雜質(zhì)，zui后用洗脫緩沖液將質(zhì)粒DNA洗脫下來。在提取液中含有RNaseA，可以在提取純化過程中除去RNA,而不用另外單獨(dú)加RNaseA除去RNA,。該方法由于不用苯酚、氯仿抽提，減少了對(duì)質(zhì)粒DNA破壞，而且純度很高，超螺旋結(jié)構(gòu)占80-90%。
1.1. 堿裂解法
一、材料、試劑和儀器
1．材料 含有質(zhì)粒的菌種
2．試劑
溶液I：
注：也可以用3M KAc代替，但效果不好。