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質(zhì)粒DNA的微量制備
最近更新時(shí)間：2015-11-23
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實(shí)驗(yàn)原理
質(zhì)粒（Plasmid）是一種雙鏈的共價(jià)閉環(huán)狀的DNA分子，它是染色體外能夠穩(wěn)定遺傳的因子。質(zhì)粒具有復(fù)制和控制機(jī)構(gòu)，能夠在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立自主的進(jìn)行自身復(fù)制，并使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)。目前，質(zhì)粒已廣泛的用作基因工程中目的基因地運(yùn)載工具—載體。從大腸桿菌中提取質(zhì)粒dna，是一種分子生物學(xué)zui基本的方法。
質(zhì)粒DNA分離純化方法有多種，但其原理和步驟都大同小異。本實(shí)驗(yàn)著重介紹堿裂解法制備微量DNA。
在EDTA存在的條件下，用溶菌酶破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，同時(shí)經(jīng)過(guò)NaOH和陰離子去污劑SDS處理，使細(xì)胞膜崩解，從而達(dá)到菌體充分的裂解。此時(shí)，細(xì)菌染色體DNA纏繞附著在細(xì)胞膜碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來(lái)。而質(zhì)粒DNA則留在上清液內(nèi)，其中還含有可溶性蛋白質(zhì)、核糖核蛋白和少量染色體DNA，實(shí)驗(yàn)中加入蛋白質(zhì)水解酶和核糖核酸酶，可以使它們分解，通過(guò)堿性酚（pH8.0）和氯仿－異戊醇混合液的抽提可以除去蛋白質(zhì)。異戊醇的作用是降低表面張力，可以減少抽提過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫，并能使離心后水層、變性蛋白層和有機(jī)層維持穩(wěn)定。含有質(zhì)粒DNA的上清液用乙醇或異丙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于細(xì)菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色體DNA容易被切斷成為各種大小不同的碎片而與質(zhì)粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有質(zhì)粒DNA外，還可能有少部分染色體DNA和RNA，必要時(shí)可進(jìn)一步純化。
試劑和器材
一、試劑
1. LB 液體培養(yǎng)基
胰蛋白胨10g/L, 酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L, 用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.5，高壓滅菌。
2. TEG緩沖液（pH8.0 25mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L EDTA, 50mmol/L葡萄糖，4mg/mL 溶菌酶）
稱取0.3g Tris加入0.1mol/L HCl溶液14.6mL，先配制成pH8.0 Tris-HCl緩沖液100mL，再加入0.37g EDTA·Na2·2H2O和0.99g葡萄糖，臨用前加入400mg溶菌酶。
3. 堿裂解液（0.2mmol/L NaOH, 1% SDS）
稱取0.8g NaOH和1g SDS定容至100mL
4. 乙酸鉀溶液(pH8.0, [K+]=3mol/L, [Ac-]=5mol/L)
取60mL mol/L KAc加入11.5mL冰乙酸和28.5mL蒸餾水
5. 1mol/L pH8.0 Tris－HCl緩沖液
Tris 121.14g/L, 用鹽酸調(diào)至pH8.0