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基因克隆的幾種常用方法
最近更新時(shí)間：2015-12-30
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基因(gene)是遺傳物質(zhì)的zui基本單位,也是所有生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。不論要揭示某個(gè)基因的功能,還是要改變某個(gè)基因的功能,都必須首先將所要研究的基因克隆出來。特定基因的克隆是整個(gè)基因工程或分子生物學(xué)的起點(diǎn)。本文就基因克隆的幾種常用方法介紹如下。
1 根據(jù)已知序列克隆基因
對(duì)已知序列的基因克隆是基因克隆方法中zui為簡(jiǎn)便的一種。獲取基因序列多從文獻(xiàn)中查取,即將別人報(bào)道的基因序列直接作為自己克隆的依據(jù)。現(xiàn)在上公開發(fā)行的雜志一般都不登載整個(gè)基因序列,而要求作者在投稿之前將文章中所涉及的基因序列在基因庫(kù)中注冊(cè),擬發(fā)表的文章中僅提供該基因在基因庫(kù)中的注冊(cè)號(hào)(accession number),以便別人參考和查詢。目前,世界上主要的基因庫(kù)有:(1)EMBL,為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基因庫(kù),其網(wǎng)上地址為http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;(2)Genbank,為設(shè)在美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫(kù),其網(wǎng)上地址為http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白質(zhì)序列庫(kù),其所含序列的準(zhǔn)確度比較高,而TREMBL只含有從EMBL庫(kù)中翻譯過來的序列。目前,以Genbank的應(yīng)用zui頻繁。這些基因庫(kù)是相互的,在Genbank注冊(cè)的基因序列,也可能在Swissport注冊(cè)。要克隆某個(gè)基因可首先通過Internet查詢一下該基因或相關(guān)基因是否已經(jīng)在基因庫(kù)中注存。查詢所有基因文庫(kù)都是免費(fèi)的,因而極易將所感興趣的基因從庫(kù)中拿出來,根據(jù)整個(gè)基因序列設(shè)計(jì)特異的引物,通過PCR從基因組中克隆該基因，也可以通過RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物種和分離株之間的差異,為了保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性,有必要采用兩步擴(kuò)增法,即nested PCR。
根據(jù)蛋白質(zhì)序列也可以將編碼該蛋白質(zhì)的基因擴(kuò)增出來。在基因文庫(kù)中注冊(cè)的蛋白質(zhì)序列都可以找到相應(yīng)的DNA或cDNA序列。如蛋白質(zhì)序列是自己測(cè)定的,那么需要設(shè)計(jì)至少1對(duì)簡(jiǎn)并引物(degenerated primer),從cDNA文庫(kù)中克隆該基因。以這種方法克隆的基因必須做序列測(cè)定才能鑒別所擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
另外,在基因克隆之后,如還要進(jìn)一步做表達(dá)研究,所使用的PCR酶不用Taq dna聚合酶,而采用其他有自我檢測(cè)(reading proof)功能的酶,如pfu。這樣可以避免由于擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的點(diǎn)突變或終止密碼子而導(dǎo)致整個(gè)研究結(jié)論的錯(cuò)誤。
2 根據(jù)已知探針克隆基因
這也是基因克隆的一種較直接的方法。首先將探針作放射性或非放射性標(biāo)記,再將其與用不同內(nèi)切酶處理的基因組DNA雜交,zui后將所識(shí)別的片段從膠中切下來，克隆到特定的載體(質(zhì)粒、噬菌體或病毒)中作序列測(cè)定或功能分析。這種方法不但可以將基因克隆出來,還能同時(shí)觀察該基因在基因組中的拷貝數(shù)。但在探針雜交后,要注意高強(qiáng)度(high stringent)漂洗,以避免干擾信號(hào),即保證克隆的特異性,同時(shí)節(jié)省時(shí)間。
3 未知序列的基因打靶
根據(jù)已知序列進(jìn)行基因克隆,多數(shù)是重復(fù)別人的工作,或者是在別人工作的基礎(chǔ)上繼續(xù)自己的工作,因而不存在新基因的克隆過程。對(duì)未知序列的基因克隆才是真正的創(chuàng)造性研究。
3．1 隨機(jī)引物法克隆未知序列基因［1］ 隨機(jī)引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因組DNA或RNA的指紋圖譜(finger print)分析,后來也有人將這種方法用于克隆與表型相關(guān)的基因或mRNA。該方法的理論依據(jù)是:表型受基因支配,在一個(gè)生物體發(fā)生了表型變化后,其基因組DNA很可能發(fā)生變化或出現(xiàn)不同基因的激活或關(guān)閉等;另一方面,如在寄生蟲的發(fā)育過程中,不同發(fā)育階段的蟲基因克隆的幾種常用方法體所表達(dá)的基因很可能不同,如將不同發(fā)育階段的蟲體mRNA提取出來,用單一引物(隨機(jī)引物,其長(zhǎng)度不超過16 nt)對(duì)不同時(shí)期的蟲體mRNA進(jìn)行擴(kuò)增比較,即可找出導(dǎo)致表型變異的遺傳學(xué)依據(jù)。這種方法是一種比較PCR,它要求至少有2種來自不同表型但又很類似的基因組DNA或mRNA。AP-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物必須99%是一致的,只有個(gè)別特異的產(chǎn)物出現(xiàn)在特異的表型個(gè)體中。該方法對(duì)表型或種源關(guān)系相差甚遠(yuǎn)的生物個(gè)體之間沒有比較意義(見圖1)。
圖1 應(yīng)用AP-PCR法進(jìn)行2種或多種表型特征類似的個(gè)體間指紋圖譜分析或表型相關(guān)基因克隆 箭頭所指擴(kuò)增帶為特異于個(gè)體(Ⅱ)的擴(kuò)增產(chǎn)物
AP-PCR的操作一般采用兩步法,即*個(gè)循環(huán)多以較低的退火溫度(annealing temperature)進(jìn)行擴(kuò)增,后20個(gè)循環(huán)則采用較高的退火溫度擴(kuò)增。AP-PCR產(chǎn)物多較短,一般需高濃度的瓊脂糖凝膠檢測(cè),也可用聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)。如擴(kuò)增的模板為mRNA,通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物的強(qiáng)度,可以得知該基因在2種生物或同一生物不同發(fā)育階段的表達(dá)強(qiáng)度。另外,在AP-PCR檢測(cè)到與某一表型相關(guān)的基因或基因產(chǎn)物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整個(gè)基因或mRNA。主要操作程序?yàn)?(1)AP-PCR產(chǎn)物的提取、克隆及序列測(cè)定。首先將AP-PCR檢測(cè)到的特定片段從凝膠中切下,提取DNA克隆到適宜的載體內(nèi)(如TA載體),再測(cè)定其核苷酸組成。根據(jù)其核苷酸組成設(shè)計(jì)2個(gè)方向相反的引物(P-1,P-2,見圖2)。引物長(zhǎng)度多在20 nt以上；退火溫度在60℃以上；(2)將基因組DNA做適當(dāng)酶切,然后在其兩端連接上相同的接頭(見圖2,這種接頭可從生物制品公司購(gòu)買)。根據(jù)接頭的序列擴(kuò)增。