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PCR常見問題分析及對策
最近更新時間：2016-1-13
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
文件類型：PNG 圖片下載次數(shù)：145次
資料類型：瀏覽次數(shù)：1089次
問題1：無擴增產(chǎn)物
現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無
原因:
1.模板:含有抑制物，含量低
2.Buffer對樣品不合適
3.引物設計不當或者發(fā)生降解
4.反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短
對策:
1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更換Buffer或調(diào)整濃度
3.重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結構）或者換一管新引物
4.降低退火溫度、延長延伸時間
PCR常見問題分析及對策(無擴增產(chǎn)物、非特異性擴增、拖尾、假陽
問題2：非特異性擴增
PCR常見問題分析及對策(無擴增產(chǎn)物、非特異性擴增、拖尾、假陽現(xiàn)象：條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶
原因：
1.引物特異性差
2.模板或引物濃度過高
3.酶量過多
4.Mg2+濃度偏高
5.退火溫度偏低
6.循環(huán)次數(shù)過多
對策：
1.重新設計引物或者使用巢式PCR
2.適當降低模板或引物濃度
3.適當減少酶量
4.降低鎂離子濃度
5.適當提高退火溫度或使用二階段溫度法
6.減少循環(huán)次數(shù)
問題3：拖尾
PCR常見問題分析及對策(無擴增產(chǎn)物、非特異性擴增、拖尾、假陽現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。
原因：
1.模板不純
2.Buffer不合適
3.退火溫度偏低
4.酶量過多
5.dNTP、Mg 2+濃度偏高
6.循環(huán)次數(shù)過多
對策：
1.純化模板
2.更換Buffer
3.適當提高退火溫度
4.適量用酶
5.適當降低dNTP和鎂離子的濃度
6.減少循環(huán)次數(shù)
問題4：假陽性
現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物
原因：
靶序列或擴增產(chǎn)物
的交*污染
對策：
1.操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；
2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管
及加樣槍頭等均應一次性使用。
3.各種試劑先進行分裝，然后低溫貯存