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質(zhì)粒DNA的小量制備
最近更新時(shí)間：2016-5-4
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準(zhǔn)備工作：
細(xì)菌培養(yǎng)：挑取單菌落，接種到3~5ml適宜的液體培養(yǎng)基(如氨芐青霉素抗性的標(biāo)準(zhǔn)lb培養(yǎng)基)中，37℃震蕩培養(yǎng)。
注：（1）在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期時(shí)提取。過早則質(zhì)粒得率太低，過晚則會(huì)有雜菌污染，或得到的質(zhì)粒雜質(zhì)太多，影響其后的酶切、電泳等處理；
（2）某些嚴(yán)緊型質(zhì)粒(如pBR322)需要在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期后，在細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)，以提高產(chǎn)量。
具體步驟：
1、細(xì)菌的收獲：將1.5ml菌液倒入微量離心管中，12000g離心30秒，吸去培養(yǎng)液。上清要?jiǎng)?wù)必吸取干凈，否則會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。必要時(shí)可以離心2次。
2、將細(xì)菌沉淀重懸于150μl用冰預(yù)冷的溶液Ｉ中，加入1/50體積RNAseA貯存液，劇烈振蕩，使之*分散。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)
不含dna酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分裝貯存
注：（1）溶液Ｉ高壓蒸氣滅菌后，貯存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于儲(chǔ)存；但提取大于15kb的質(zhì)粒，應(yīng)將細(xì)菌懸于等滲蔗糖溶液中，并用溶菌酶處理；（3）務(wù)必使細(xì)菌沉淀*分散，以利于堿液作用充分；（4）震蕩時(shí)可以在離心管中加入牙簽或槍頭，提率；（5）配制RNaseA貯存液時(shí)，煮沸時(shí)間不宜過長(zhǎng)或過短；（6）溶液Ｉ每2個(gè)月重新配制1次。
3、加200μl溶液Ⅱ，顛倒混勻。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS
注：（1）若菌體裂解得充分，則溶液會(huì)變得很粘稠；（2）不要?jiǎng)×艺鹗帲駝t會(huì)混入基因組DNA；（3）每2個(gè)月重新配制1次。
4、加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，輕微震蕩混勻
溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml
注：（1）所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）盡量不要有大的塊狀沉淀，以利于下步離心；（3）每1個(gè)月重新配制1次，并分裝貯存于小口瓶中。
5、12000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
6、加入1/2體積的Tris飽和酚、1/2體積的氯仿-異戊醇(24:1)混合液，劇烈震蕩混勻。
7、12000g離心5分種，將上層液體轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
注：為了保證不吸出下層液體，可以先離心30秒，然后將上層與少量下層液體吸至另一離心管，離心5分種，再轉(zhuǎn)移上層液體。切勿混入下層液體。
8、加入60%體積的異丙醇，顛倒混勻后，室溫靜置5分鐘。12000g離心５~10分鐘，小心吸去上清液。
注：（1）沉淀即為質(zhì)粒DNA；（2）為確保質(zhì)粒*沉淀，異丙醇的體積可以適當(dāng)加大至62~65%。
9、0.8ml70%乙醇洗滌DNA沉淀后，小心地吸去上清。在空氣中靜置3~10分鐘，待沉淀干燥后，溶解于50μl高壓滅菌的水中。
注：為洗滌充分，可以洗2次。
10、取1~2μl樣品測(cè)定紫外吸光度，對(duì)所得質(zhì)粒進(jìn)行定量并了解其純度，或取1~2μl樣品進(jìn)行瓊脂糖電泳，估計(jì)其純度和得率。
所得質(zhì)粒不能進(jìn)行很好的酶促反應(yīng)的主要原因：1、細(xì)菌收獲時(shí)，培養(yǎng)液沒有吸除干凈；2、各種液體放置時(shí)間過長(zhǎng)；3、沉淀中混入痕量酚、蛋白或過多乙醇；4、干燥沉淀時(shí)，在空氣中靜置時(shí)間過長(zhǎng)（數(shù)小時(shí)）
質(zhì)粒得率過小的主要原因：1、細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間不夠；2、細(xì)菌沉淀重懸于溶液Ｉ時(shí)，沒有*分散；3、加溶液Ⅱ后，裂解得不充分；3、各種液體放置時(shí)間過長(zhǎng)而失效；4、加入異丙醇的量不夠；5、洗滌用的乙醇溶液濃度<60%；6、嚴(yán)緊型質(zhì)粒應(yīng)適當(dāng)加大培養(yǎng)體積，并用氯霉素處理