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外源DNA和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)原理與步驟
最近更新時(shí)間：2016-8-22
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外源DNA片段和線狀質(zhì)粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價(jià)鏈。如質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個(gè)新的磷酸二酯鏈。但如果質(zhì)粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個(gè)新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產(chǎn)生的兩個(gè)雜交體分子帶有2個(gè)單鏈切口，當(dāng)雜本導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。相鄰的5'磷酸和3'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的dna連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實(shí)際上在有克隆用途中，T4噬菌體DNA連接酶都是的用酶。這是因?yàn)樵谙鲁练磻?yīng)條件下，它就能有效地將平端DNA片段連接起來(lái)。
DNA一端與另一端的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，其反應(yīng)速度*由互相匹配的DNA末端的濃度決定。不論末端位于同一DNA分子(分子內(nèi)連接)還是位于不同分子(分子間連接)，都是如此?，F(xiàn)考慮一種簡(jiǎn)單的情況，即連接混合物中只含有一種DNA，也就是用可產(chǎn)生粘端的單個(gè)限制酶切割制備的磷酸化載體DNA。在瓜作用的底物。如果反應(yīng)中DNA濃度低，則配對(duì)的兩個(gè)末端同一DNA分子的機(jī)會(huì)較大(因?yàn)镈NA分子的一個(gè)末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率)。這倦，在DNA濃度低時(shí)，質(zhì)粒dna重新環(huán)化將卓有成效。如果連接反應(yīng)中DNA濃度有所增高，則在分子內(nèi)連接反應(yīng)發(fā)生以前，某一個(gè)DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA濃度高時(shí)，連接反的初產(chǎn)物將是質(zhì)粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時(shí)參見(jiàn)Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊)從理論上探討了DNA濃度對(duì)連接產(chǎn)物性質(zhì)的影響。簡(jiǎn)而言之，環(huán)化的連接產(chǎn)物與多聯(lián)體連接產(chǎn)物的比取決于兩個(gè)參數(shù)：j和i。j是DNA分子的一個(gè)末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數(shù)值是根據(jù)如下一種假設(shè)作出的：沉吟液中的DNA呈隨機(jī)卷曲。這樣，j與DNA分子的長(zhǎng)度成反比(因?yàn)镈NA越長(zhǎng)，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用)，因此j對(duì)給定長(zhǎng)度的DNA分子來(lái)說(shuō)是一個(gè)常數(shù)，與DNA深度無(wú)關(guān)。j=[3/(3πlb0)]3/2其中l(wèi)是DNA長(zhǎng)度，以cm計(jì)，b是隨機(jī)卷曲的DNA區(qū)段的長(zhǎng)度。b的值以緩沖液的離子強(qiáng)度為轉(zhuǎn)移，而后者可影響DNA的剛度。
i是溶液中所有互補(bǔ)末端的深度的測(cè)量值，對(duì)于具有自身互補(bǔ)粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里No是阿佛伽德羅常數(shù)，M是DNA的摩爾濃度(單位：mol/L)。理論上，當(dāng)j=i時(shí)，給定DNA分子的一個(gè)末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應(yīng)的初始階段中，環(huán)狀分子與多聯(lián)體分子的生成速率相等。而當(dāng)j>i時(shí)，有利于重新環(huán)化;當(dāng)i>j，則有利于產(chǎn)生多聯(lián)體。圖1.9顯示了DNA區(qū)段的大小與連接反應(yīng)混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時(shí)所需DNA濃度之間關(guān)系(Dugaiczyk等，1985)。 現(xiàn)在考慮如下的連接反應(yīng)混合物：其中除線狀質(zhì)粒之外，還含有帶匹配末端的外源dna片段。對(duì)于一個(gè)給定的連接混合物而言，產(chǎn)生單體環(huán)狀重組基因組的效率不僅受反應(yīng)中末端的濃度影響， 而且還受質(zhì)粒和外源DNA末端的相對(duì)濃度的影響。當(dāng)i是j的2-3倍(即末端的濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時(shí))外源DNA末端濃度的2倍時(shí)，有效重組體的產(chǎn)量可達(dá)到zui大。這些條什下，連接反應(yīng)終產(chǎn)物的大約40%都是由單體質(zhì)粒與外源DNA所形成的嵌合體。當(dāng)連接混合物中線瘃質(zhì)粒的量恒定(j:i=3)而帶匹配末端的外源DNA的量遞增時(shí)，這種嵌合體在連接反應(yīng)之末的理論產(chǎn)量。
涉及帶粘端的線狀磷酸化質(zhì)粒DNA的連接反應(yīng)應(yīng)包含：
1)足量的載體DNA，以滿足j:i>1和j:i<3。對(duì)一個(gè)職pUC18一般大小的質(zhì)粒，這意味著連接反應(yīng)中應(yīng)含有載體DNA為20-60μg/ml。
2)未端濃度等于或稍高于載體DNA的外源DNA，如外源DNA濃度比載體低得多，在效連接產(chǎn)物的數(shù)量會(huì)很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉(zhuǎn)化菌落。這種情況下，可考慮采用一些步驟來(lái)減少帶非重組質(zhì)粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質(zhì)粒DNA或發(fā)跡克隆策略以便通過(guò)定向克隆的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒。