士鋒生物放射免疫分析法的建立

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相關(guān)產(chǎn)品：

一、放射免疫分析的基本試劑

（一）標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品是放射免疫分析法定量的依據(jù)，由于以標(biāo)準(zhǔn)品的量用來表示被涮物質(zhì)的量，故標(biāo)準(zhǔn)品與被測(cè)物質(zhì)應(yīng)當(dāng)化學(xué)結(jié)構(gòu)一致并具有相同免疫活性。標(biāo)準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)。應(yīng)要求高度純化。標(biāo)準(zhǔn)品除含量應(yīng)具有準(zhǔn)確性外，還應(yīng)具備穩(wěn)定性，即在合理的貯存條件下保持原來的特性。

按實(shí)驗(yàn)要求，將標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液配成含不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（二）標(biāo)記物

標(biāo)記抗原應(yīng)具備：①比放射性高，以保證方法的靈敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡可能長(zhǎng)，標(biāo)記一次可較長(zhǎng)時(shí)間使用，這對(duì)來之不易的抗原尤其重要；④標(biāo)記簡(jiǎn)便、易防護(hù)。

要準(zhǔn)確測(cè)量B與F的放射性，必須有足夠的放射性強(qiáng)度。所選用的標(biāo)記抗原的量，在使用125I時(shí)達(dá)5000～15000cpm。

（三）抗體

應(yīng)選擇特異性高、親和力強(qiáng)及滴度好的抗體，用于放射免疫測(cè)定。

根據(jù)稀釋曲線，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪龋话阋越Y(jié)合率為50%作為抗血清的稀釋度。

（四）B與F分離劑

以2%加膜活性炭溶液為例，2%加膜活性炭溶液的配制：

活性炭2g（杭州木材廠生產(chǎn)，森工牌732型）

右旋糖酐T200.2g

加0.1mol/L PB 至100ml

電磁攪拌1h，然后置于變通冰箱冰箱待用。

（五）緩沖液

放射免疫分析技術(shù)所用的緩沖液有多種，要通過實(shí)驗(yàn)選用抗體和抗原結(jié)合zui高的緩沖液。

目前zui常用的緩沖液有下列幾種：①磷酸鹽緩沖液；②醋酸鹽緩沖液；③巴比妥緩沖液；④Tris –HCl緩沖液；⑤硼酸緩沖淮。其中以磷酸鹽緩沖液應(yīng)用zui多。

在緩沖液中，除必須有弱酸及弱酸的鹽成分外，還應(yīng)根據(jù)不同檢測(cè)項(xiàng)目加入下列物質(zhì)：①保護(hù)蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明膠，濃度為0.1%～0.2%，用以降低試管對(duì)抗原的非特異性吸附。②防腐劑：多采用0.1%疊氮鈉、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制劑：如測(cè)定心鈉素等肽類激素時(shí)，要加入適量的抑肽酶，用以抑制血漿內(nèi)源性水解酶對(duì)待測(cè)物的降解；又如測(cè)定cAMP、cGMP時(shí)，需加入EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻斷劑：在測(cè)定甲狀腺激素或測(cè)定某些甾體激素時(shí)，必須加阻斷劑，使和蛋白質(zhì)相結(jié)合的激素，變?yōu)橛坞x型。常用的阻斷劑有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水楊酸鈉、三氯醋酸鈉等。⑤載體蛋白：采用二抗作B與F分離劑時(shí)，要向反應(yīng)液中加入適量與*抗體同種動(dòng)物的正常血清。在測(cè)定不含有血漿蛋白的樣品時(shí)，用PEG沉淀劑分離B、F，必須加適量γ球蛋白或正常人混合血清。

在神經(jīng)肽的RIA時(shí)，常用PELH緩沖液，（按1000ml,pH7.6）：

0．1mol/l PB 980.0ml

0.3mol/L EDTA·2Na 10.0ml

0.2%洗必泰溶液 10.0ml

溶菌酶 1.0g

二、加樣程序

由于抗原、標(biāo)記抗原和抗體三者加樣次序不同，而出現(xiàn)兩種加樣程序，分述如下：

（一）平衡飽和加樣程序

1．基本原理所謂平衡飽和，是指抗原和抗體反應(yīng)達(dá)到再不結(jié)合，也不解離的平衡狀態(tài)，稱為飽和狀態(tài)，即平衡飽和。所以，有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測(cè)抗原、標(biāo)記抗原、抗體三者一起溫育。

2．加樣程序一般先加標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)樣品，再加抗血清，zui后加標(biāo)記物。這樣的順序是讓標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)物與抗體有短暫的結(jié)合，提高抗原的競(jìng)爭(zhēng)抑制能力。

在小分子半抗原的放射免疫分析中，標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合的親合力常常是不相同的，前者比后者的親合力高。因此，上述加樣程序就更有必要，所以一般都采用先加標(biāo)準(zhǔn)物或樣品和抗血清，后加標(biāo)記物。這樣測(cè)定也比較穩(wěn)定。

在大分子蛋白質(zhì)抗原的放射免疫分析中，如果是雙抗體分離法，抗原和標(biāo)記抗原與抗體三者加樣，可不分先后，有的是標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)記物、抗血清的加樣順序，但一般習(xí)慣還是標(biāo)準(zhǔn)物或血樣、抗血清、標(biāo)記物、然后混勻溫育24～48h，再加雙抗體，繼續(xù)溫育24h，使免疫反應(yīng)達(dá)到平衡。對(duì)一些多肽激素的放射免疫分析，應(yīng)用雙抗體分離法，其流程比較長(zhǎng)，這樣的順序同樣可不分先后。

以大鼠垂體、下丘腦β-內(nèi)啡肽RIA測(cè)定程序?yàn)槔?/p>

（1）加樣（單位μl；總反應(yīng)體積500μl）

    標(biāo)準(zhǔn)曲線    樣品
    T    NSB    Bo    5Pg    10Pg    50Pg    100Pg    500Pg    1ng    垂體    下丘腦
管號(hào)    1    2    3    4    5    6    7    8    9    10    11
β-EP標(biāo)準(zhǔn)液    /    /    /    100    100    100    100    100    100    /    /
樣品    /    /    /    /    /    /    /    /    /    1    100
β-EP抗血清    /    /    100    100    100    100    100    100    100    100    100
125-β-EP溶液

100    100    100    100    100    100    100    100    100    100    100
緩沖液    /    400    300    200    200    200    200    200    200    299    200
（2）孵育：4℃，24h

（3）分離B與F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，搖勻，立即離心，去上清，測(cè)沉淀（F）的CPM數(shù)。

（二）順序飽和加樣程序

1．基本原理先將標(biāo)準(zhǔn)物或血樣品與抗血清混勻，免疫反應(yīng)6～24h，使抗原與抗體充分結(jié)合，甚至達(dá)到平衡，然后再加入標(biāo)記抗原，與抗體反應(yīng)12～24h，zui后分離B與F，這稱為順序飽和分析法。

應(yīng)用順序飽和加樣，可以提高測(cè)定方法的靈敏度。Utiger在做人促甲狀腺激素（TSH）放射免疫分析時(shí)，將標(biāo)記物延至第2天加入，發(fā)現(xiàn)其靈敏度增加兩倍。如果縮短zui后的溫育時(shí)間，仍可取得滿意的結(jié)果。所以一般認(rèn)為，在順序飽和加樣中，第1次溫育時(shí)間可以長(zhǎng)，而第2次溫育時(shí)間要短，這樣可以提高靈敏度。但也有相反的意見，認(rèn)為順序飽和加樣，是使用過量抗體，會(huì)使靈敏度受到一定影響。如果使用抗體不過量，溫育時(shí)間縮短，在抗原和抗體結(jié)合未達(dá)到平衡飽和時(shí)就加入標(biāo)記物，這樣既不影響加靈敏度，反而比較穩(wěn)定，甚至可提高靈敏度。

2．加樣程序 以人血漿精氨酸加壓素RIA測(cè)定程序?yàn)槔ㄖ苯訙y(cè)定）。

（1）加樣（單位μl；總反應(yīng)體積600μl）

    標(biāo)準(zhǔn)曲線    血漿
T    NSB    Bo    1Pg    5Pg    10Pg    50Pg    100Pg    500Pg
管號(hào)    1    2    3    4    5    6    7    8    9    10
AVP標(biāo)準(zhǔn)液    /    /    /    100    100    100    100    100    100    /
樣品    /    /    /    /    /    /    /    /    /    300
無肽血漿    /    300    300    300    300    300    300    300    300    /
AVP抗血清    /    /    100    100    100    100    100    100    100    100
緩沖液    /    200    100    /    /    /    /    /    /    100
在4。C下孵育12～24h
125I-AVP

100    100    100    100    100    100    100    100    100    100
（2）孵育：4℃，24h。

（3）分離B與F。

無肽血漿，用于血漿的直接測(cè)定。其制備方法為：在電磁攪拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共兩管，離心、去上清。血漿5ml，倒入上述活性炭管中，加蓋，充分振蕩10min，離心，上清倒入上述另一活性炭管中，振蕩10min，再離心，取上清，即無肽血漿。血漿中的生物活性物質(zhì)被活性炭吸附而去除。

（三）計(jì)數(shù)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線與測(cè)定樣品含量

以活性炭分離B與F，沉淀計(jì)數(shù)是F的cpm。T—F—NSB，得B的cpm數(shù)。

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)管與樣品管結(jié)合（B）的cpm數(shù)及與零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合（B0）的比（B/B0×100%）。

用半對(duì)數(shù)紙，以標(biāo)準(zhǔn)管的B/B0為縱座標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)管含量為橫座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)樣品的結(jié)合率（B/B0×100%），從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找出被測(cè)樣品抗原的含量，再換算成每毫升血漿含某抗原的量，或每毫克（組織濕重）含某抗原的量。

三、放射免疫分析的質(zhì)量控制

（一）質(zhì)量控制的目的和內(nèi)容

放射免疫分析的質(zhì)量控制實(shí)際上就是控制測(cè)定誤差，監(jiān)督測(cè)定結(jié)果。它包括兩方面的內(nèi)容：一方面對(duì)測(cè)定結(jié)果做分析；另一方面鑒定常規(guī)測(cè)定方法，對(duì)那些測(cè)定結(jié)果不好的方法加以改進(jìn)，并建立新的測(cè)定方法。質(zhì)量控制分四個(gè)方面：

1．在一個(gè)測(cè)定方法內(nèi)產(chǎn)生的誤差。

2．在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同方法之間產(chǎn)生的誤差。

這兩種情況屬于內(nèi)部質(zhì)量控制。

3．用同一測(cè)定方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的誤差。

4．采用不同方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的誤差。

后兩種情況屬于外部質(zhì)量控制。

（二）放射免疫分析中造成測(cè)量誤差的因素

誤差包括系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差。系統(tǒng)誤差發(fā)生在測(cè)量過程中由于儀器不準(zhǔn)、試劑不純、標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定等原因，使測(cè)定結(jié)果呈傾向性偏大或偏小，這種誤差應(yīng)力求避免。隨機(jī)誤差是測(cè)量過程中各種偶然因素造成的，沒有固定的傾向性，這類誤差是不可避免的，必要時(shí)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

造成誤差的可能來源有以下幾個(gè)方面：

1．各種儀器：設(shè)備的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、效率以及被污染等情況帶來的誤差。如：①由于放射性測(cè)量?jī)x器的穩(wěn)定性、效率、樣品試管的材料和均勻性及被測(cè)物的放射性強(qiáng)度等原因。②由于樣品的自吸收，本底校正，測(cè)定時(shí)間，可能的污染等原因。③在試驗(yàn)室中所有的移液管、微量取樣器以及天平的刻度、校準(zhǔn)和使用方法等原因。④由于反應(yīng)試管、移液管以及測(cè)定用試管等表面清潔度和所引起的不同吸附等原因都可以對(duì)測(cè)定結(jié)果帶來誤差。

2．試劑的純度、質(zhì)量和穩(wěn)定性的影響也是造成誤差的重要因素。如標(biāo)記抗原的比度、純度，輻射自分解，抗體的穩(wěn)定性，分離劑、阻斷劑及緩沖液等試劑的純度等。

3．在放射免疫分析中一些基本操作，如取樣、提取、沉淀、分離以及保溫條件不適當(dāng)?shù)仍斐傻恼`差。由于工作人員熟練程度不同也常常帶來誤差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹氣與不吹氣等。工作人員草率、不按規(guī)程操作等也都可以造成誤差。

4．樣品誤差。樣品的收集方法、貯存溫度、放置條件，微量樣品取樣的準(zhǔn)確度，樣品可能造成的污染以及樣品的變性（如免疫反應(yīng)活性的降低、蛋白質(zhì)的變性等）也都能造成測(cè)量的誤差。

5．提取及層析分離過程中的丟失。

（三）放射免疫分析中測(cè)量誤差的控制

1．選擇準(zhǔn)確性高的方法：對(duì)各種方法進(jìn)行比較，淘汰粗糙及難以重復(fù)的方法。

2．建立方法對(duì)比。用相同的測(cè)量方法和不同的測(cè)量方法在同一實(shí)驗(yàn)室和不同實(shí)驗(yàn)室，在同一地區(qū)和不同地區(qū)，在同一時(shí)間和不同時(shí)間，對(duì)同一樣品進(jìn)行對(duì)比，檢查產(chǎn)生誤差的原因。

3．建立各種類型的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)規(guī)定純度及制備方法，使用年限及貯存條件。

4．建立操作規(guī)程，按章 操作。對(duì)使用的試劑、儀器設(shè)備要經(jīng)常檢查其有效性，更換試劑時(shí)應(yīng)進(jìn)行必要的鑒定，必要時(shí)對(duì)測(cè)定方法要做重復(fù)性試驗(yàn)和回收試驗(yàn)。

5．建立可靠的檢查制度。經(jīng)常對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行核查，利用控制血清、標(biāo)準(zhǔn)血清檢查每批結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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