酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)步驟和技巧分析

最近更新時(shí)間：2013-4-5

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LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介

一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原理

報(bào)告質(zhì)粒p8op-LacZ的GAL4 UAS編碼序列被*去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄活性為零，該基因的篩選標(biāo)志為URA3，可以作為有自主復(fù)制能力的質(zhì)粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。

質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3，在雙雜交系統(tǒng)中用于表達(dá)DNA-BD（202個(gè)氨基酸殘基組成的LexA蛋白）與目標(biāo)蛋白（釣餌，Bait）的融合蛋白，該融合體的表達(dá)受酵母強(qiáng)啟動(dòng)子ADH1的調(diào)控，選擇與報(bào)告基因的操縱子LexA×8結(jié)合。

質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為T(mén)RP1，在其供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)（EcoR I與Xho I）上游，含有SV40核定位（SV40 nuclear localization）、HA（血凝素）及AD（來(lái)自于E.coli的88個(gè)氨基酸殘基組成的B42蛋白）等幾種編碼序列，共同組成可以啟動(dòng)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的激活成份。

在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個(gè)報(bào)告基因Leu，它與LacZ報(bào)告基因具有相同的操縱子-LexA，但兩者啟動(dòng)子不同。

根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復(fù)合物同時(shí)具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。分別將待測(cè)蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)中，然后共同轉(zhuǎn)入含有報(bào)告基因的酵母菌株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強(qiáng)弱。

如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫(kù)，則可用X從該文庫(kù)中篩選出能與其相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的組成

1. 載體質(zhì)粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文庫(kù)

2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侶菌株）

3. 大腸桿菌菌株：E.coli KC8株

4. 對(duì)照質(zhì)粒：

質(zhì) 粒 用途

pLexA-53，pB42AD-T 陽(yáng)性對(duì)照

pLexA-Pos（LexA/GAL4 AD融合蛋白〕 陽(yáng)性對(duì)照

pLexA-Lam（LaminC蛋白少與其它蛋白相互作用） 假陽(yáng)性檢測(cè)質(zhì)粒

5. 引物：

pLexA測(cè)序引物及pB42AD測(cè)序引物。

三、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的基本流程

1. 將報(bào)告基因p8op-LacZ轉(zhuǎn)化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。

2. 同時(shí)構(gòu)建或擴(kuò)增DNA文庫(kù)，并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。

3. 構(gòu)建DNA-BD/靶蛋白質(zhì)粒pLexA-X，作為釣餌（bait）。

4. 將上述釣餌質(zhì)粒pLexA-X轉(zhuǎn)化EGY48（p8op-LacZ）細(xì)胞株，用SD/-His/-Ura篩選;并用固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測(cè)此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活報(bào)告基因的活性，以及對(duì)酵母細(xì)胞是否具有殺傷毒性。

轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 選擇培養(yǎng)基 克隆生長(zhǎng)情況 說(shuō) 明

（含有Gal/Raf）

pLexA-Pos SD/-His，-Ura 藍(lán) 陽(yáng)性對(duì)照

pLexA SD/-His，-Ura 白 陰性對(duì)照

PlexA-X SD/-His，-Ura 白 沒(méi)有直接激活活性

PlexA-X SD/-His，-Ura 藍(lán) 具有直接激活活性

PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生長(zhǎng) 酵母細(xì)胞毒性

4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信號(hào)作用。b能夠自動(dòng)激活報(bào)告基因，則設(shè)法去除其激活活性部位、或者將LacZ報(bào)告基因整合入基因組，減少

4-2. 如果pLexA-X雖然不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，但對(duì)酵母宿主細(xì)胞有毒性，則需要與純化的文庫(kù)DNA同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母。

5. 如果pLexA-X既不會(huì)自動(dòng)激活報(bào)告基因，也不具有毒性，則可以與純化的文庫(kù)DNA同時(shí)、或順序轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，并檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。

轉(zhuǎn) 化 質(zhì)粒 SD固體培養(yǎng)基 LacZ表型

對(duì)照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 藍(lán)

對(duì)照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 藍(lán)

+pB42AD-T

實(shí) 驗(yàn) pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待測(cè)

+pB42AD-文庫(kù)

5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽(yáng)性共轉(zhuǎn)化子，并擴(kuò)增，使宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒在誘導(dǎo)前達(dá)到zui大拷貝數(shù)。

-半乳糖苷酶無(wú)表達(dá)。b5-2. 上述重組子轉(zhuǎn)至含X-gal的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，觀察LacZ及Leu報(bào)告基因的表達(dá)情形，藍(lán)色克隆即為陽(yáng)性。白色克隆為假陽(yáng)性，說(shuō)明Leu雖有表達(dá)，但

5-3. 同時(shí)用LacZ、Leu兩個(gè)報(bào)告基因的目的，是為了盡可能消除實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性誤差，譬如：AD融合蛋白不與目標(biāo)蛋白結(jié)合，而直接與啟動(dòng)子序列結(jié)合域結(jié)合等情況。由于2個(gè)報(bào)告基因的啟動(dòng)子不同，出現(xiàn)上述假陽(yáng)性的幾率就大大減少了。

5-4. 將藍(lán)色陽(yáng)性克隆進(jìn)行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫(kù)質(zhì)粒。

6. 陽(yáng)性克隆的篩選

6-1. 隨機(jī)選取50個(gè)陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增、抽提酵母質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化E.coli KC8宿主菌，抽提大腸桿菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫(kù)質(zhì)粒。

6-2. 如果重復(fù)的插入序列較多，可另取50個(gè)陽(yáng)性克隆來(lái)分析。zui后得到數(shù)種片段大小不同的插入序列，再轉(zhuǎn)化新的宿主細(xì)胞，檢測(cè)是否仍為陽(yáng)性克隆。

7. 用質(zhì)粒自然分選法（Natural Segregation）篩除只含有AD-文庫(kù)雜合子的克隆

7-1. 將初步得到的陽(yáng)性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2天，含有HIS3編碼序列的BD-靶質(zhì)粒在含有外源His培養(yǎng)基中，將以10%-20%左右的頻率隨機(jī)丟失。

C孵育2-3天。°7-2. 將上述克隆，轉(zhuǎn)鋪固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ura，30

7-3. 再挑取生長(zhǎng)的單克隆，轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫(kù)雜合子的重組子。

7-4. 將His表型缺陷的克隆轉(zhuǎn)化固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以驗(yàn)證AD-文庫(kù)能否直接激活報(bào)告基因的表達(dá)，棄去陽(yáng)性克隆，保留陰性克隆。

8. 酵母雜合試驗(yàn)（Yeast Mating）確定真陽(yáng)性克隆

如下表所示，在酵母EGY48及其對(duì)應(yīng)的YM4271宿主細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的質(zhì)粒或文庫(kù)DNA，通過(guò)雜合實(shí)驗(yàn)確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫(kù)確實(shí)具有相互作用的真陽(yáng)性克隆。

質(zhì)粒1

（in YM4271） 質(zhì)粒2

（in EGY48） LacZ表型 Leu表型

pLexA pB42AD 白 不能生長(zhǎng)

pLexA-靶DNA pB42AD 白 不能生長(zhǎng)

pLexA pB42AD-文庫(kù) 白 不能生長(zhǎng)

pLexA-靶DNA pB42AD-文庫(kù) 藍(lán) 真 陽(yáng) 性

pLexA-Lam pB42AD-文庫(kù) 白 不能生長(zhǎng)

9. 陽(yáng)性克隆的進(jìn)一步篩選和確證

9-1. 擴(kuò)增初步確定的陽(yáng)性克隆，抽提酵母DNA。該DNA為混合成份，既含有酵母基因組DNA，也含有3種轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。

9-2. 將上述DNA電轉(zhuǎn)化E.coli KC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，具有不同復(fù)制起始調(diào)控序列的質(zhì)粒不相容;同時(shí)利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含有AD-文庫(kù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才能生長(zhǎng)，將其擴(kuò)增、并抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定。

9-3. 用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫(kù)DNA一一對(duì)應(yīng)、共轉(zhuǎn)化只含有報(bào)告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴(kuò)增，并與后面的誘導(dǎo)板形成對(duì)照，說(shuō)明報(bào)告基因的表達(dá)與誘導(dǎo)AD融合蛋白的表達(dá)有關(guān)，再確證LacZ、Leu報(bào)告基因的表達(dá)。

9-4. 擴(kuò)增與靶DNA相互作用的文庫(kù)DNA，進(jìn)行序列分析及進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)、功能研究。

10. 對(duì)雙雜交系統(tǒng)陽(yáng)性結(jié)果的進(jìn)一步研究

10-1. 用不同的雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證

10-1-1. 將載體 pLexA與pB42AD互換后進(jìn)行雙雜交實(shí)驗(yàn)。

10-1-2. 選擇不同的雙雜交系統(tǒng)，如：以GAL4轉(zhuǎn)錄激活子為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)。

10-1-3. 將文庫(kù)質(zhì)粒移碼突變后，再與靶質(zhì)粒作用，報(bào)告基因是否仍能被激活。

-半乳糖苷酶水平，比較作用強(qiáng)度變化。b10-1-4. 去除或突變特定結(jié)合位點(diǎn)，定量檢測(cè)

10-2. 用試劑盒提供的引物測(cè)定插入片段的DNA序列，證明其編碼區(qū)域。

10-3. 用其它的檢測(cè)方法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來(lái)證明雙雜交系統(tǒng)篩選的蛋白之間的具有相互作用。

10-4. 進(jìn)一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功能關(guān)系

構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增

1. 自-80℃冰箱取出含有cDNA文庫(kù)的甘油菌，置于冰浴中緩慢化凍。

2. 用新鮮的LB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中將上述甘油菌1:106和1:108稀釋。

lml加入90m3. 取稀釋菌液各10 90mm）;37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜或30℃培養(yǎng)24-36hr，計(jì)數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fLB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中振蕩混勻，涂布LB/Amp平板（

4. 確定待擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)×108（1:106稀釋?zhuān)┗蚩寺?shù)×1010（1:108稀釋?zhuān)?/p>

5. 按照>150mm），共100塊;37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。f2-4×104cfu/平板的濃度，涂布LB/Amp平板（

6. 在超凈工作臺(tái)上，在所有生長(zhǎng)菌落的平板上加適量LB培養(yǎng)液，將菌落刮下，轉(zhuǎn)入2000ml LB/Amp培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2-4hr。

7. 留取適量培養(yǎng)菌液以50%無(wú)菌甘油稀釋至25%終濃度，分裝，保存于-80℃。

8. 其余培養(yǎng)菌液離心8000xg×10min，4℃收集細(xì)菌;用質(zhì)粒DNA純化試劑盒大量抽提質(zhì)粒DNA。

LB液體培養(yǎng)基，121℃，15lb/in2滅菌15min

A. bacto-Tryptone 10.0g

B. bacto-Yeast Extract 5.0g

C. NaCl 10.0g

D. ddH2O → 1000 ml

* LB固體培養(yǎng)平板為含有1.5%瓊脂（Agar）LB培養(yǎng)基。

** LB/Amp培養(yǎng)基為含有Amp g/ml的LB培養(yǎng)基。m50-100

構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫(kù)的純化

1. 質(zhì)粒DNA提取緩沖液

名 稱(chēng) 緩沖 液 配 方

g/ml RNasemP1 懸浮緩沖液 50mM Tris-HCl（pH8.0）;10mM EDTA;100 A

P2 裂解緩沖液 200mM NaOH;1% SDS

P3 中和緩沖液 3.0M Kac（pH5.5）

QBT 平衡緩沖液 750mM NaCl;50mM MOPS（pH7.0）;15%異丙醇;0.15% Triton X-100

QC 洗滌緩沖液 1.0 M NaCl;50mM MOPS（pH7.0）;15%異丙醇

QF 洗脫緩沖液 1.25 M NaCl;50mM Tris-HCl（pH8.5）;15%異丙醇

2. 培養(yǎng)菌液離心6000xg×10min，4℃，每500ml培養(yǎng)物（下同）的沉淀重懸于50ml P1緩沖液。

3. 加入50ml P2緩沖液，倒置4-6次混勻，室溫孵育5min。

4. 加入4℃預(yù)冷的50ml P3緩沖液，快速倒置4-6次混勻，冰浴30min（其間再倒置混勻4-6次）。

5. 將上述混合液再倒置混勻，離心12000xg×30min，4℃，保留上清。

6. 上清再離心12000xg×15min，4℃，留上清。

7. 將上清液上樣于經(jīng)35ml QBT緩沖液平衡的QIAGEN-tip層析柱。

8. 以100ml QC緩沖液洗滌層析柱2次。

9. 以35ml QF緩沖液洗脫吸附于層析柱上的DNA。

10. 以0.7倍體積異丙醇沉淀DNA，離心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。

11. 以7ml 70%乙醇洗滌沉淀DNA，離心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。

12. 將沉淀的質(zhì)粒DNA溶于5ml TE（pH8.0）緩沖液，轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌離心管中，用2.5倍體積無(wú)水乙醇;1/10體積3.0M NaAc（pH5.2），于-20℃靜置過(guò)夜。

13. 離心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗滌，超凈臺(tái)風(fēng)干。

l），保存于-20℃。mg/管（用于1次轉(zhuǎn)化反應(yīng)，約40m14. 干燥的DNA溶于適量體積TE，定量，分裝100-200

構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

1. 將酵母菌EGY48（p8op-lacZ）接種于5.0ml SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0ml SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。

SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min

A. Difco Nitrogen 0.67g

B. 葡萄糖 2.00g

C. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 10.0ml

D. 20×His 5.0ml

E. 20×Leu 5.0ml

F. 20×Trp 5.0ml

G. ddH2O → 100.0ml

2. 將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。

YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min

A. Polypepton 6.0g

B. bacto-Yeast Extract 3.0g

C. 葡萄糖 6.0g

D. ddH2O → 300 ml

3. 室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25ml ddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

4. 準(zhǔn)備下列試劑

2×轉(zhuǎn)化反應(yīng) 10×TE 10×LiAc 50% PEG ddH2O

lml / 120ml 15mA. 1×TE/LiAc 0.15ml 15

l /ml 960ml 120mB. PEG/LiAc 1.20ml 120

lml / / 900mC. 1×TE 1.00ml 100

5. 分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，振蕩混勻。

lmg） 3-5mA. pLexA-X（0.1

B. 10mg/ml lmSperm DNA*（0.1mg） 10

* 新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。

l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m6. 每管加入100

lm7. 各加入600 PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。

lm8. 各加入70 DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。

9. 室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml 1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。

SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板

A. Difco Nitrogen 1.34g

B. 葡萄糖 4.00g

C. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 20.0ml

D. 20×Leu 10.0ml

E. 20×Trp 10.0ml

F. Agar 4.00g

G. ddH2O 90-100mm）f→ 200.0ml 鋪8-10塊平板（

附表1. 不同規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

Small Scale* Large Scale Library Scale

轉(zhuǎn) 化 反 應(yīng) 20 1 1

（1） SD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌 100ml 100ml 300ml

（2） YPD液體培養(yǎng)基擴(kuò)增酵母菌 300mla 300mla 1000mla

（3） TE或ddH2O洗滌酵母細(xì)胞 15mlc 25-50mlb 500mla

（4） 準(zhǔn)備 A. 1×TE/LiAc緩沖液 1.5mld 1.0mld 8.0mlc

B. PEG/LiAc緩沖液 12.0mlc 6.0mlc 100.0mlb

C. 1×TE緩沖液 6.0mlc 10.0mlc 10.0mlc

（5） 分裝 A. DNA-BD vector gd×20 / 0.2-1.0mgcm 0.1

gd 0.1-0.5mgmg×20 10-50mB. AD vector 0.1

C. l 2.0mlml×20 200mSperm DNA（10mg/ml） 10

1×TE/LiAc重懸感受態(tài)細(xì)胞 1.5mlc 1.0mlc 8.0mlb

l×20 1.0ml 8.0mlm酵母感受態(tài)細(xì)胞 100

（7） PEG/LiAc緩沖液 0.6ml×20 6.0ml 60.0ml

l 7.0mlml×20 700m DMSO 70

（9） 室溫離心后棄上清 13000xg×10sec 2000xg×5min 2000xg×5min

（10） 1×TE重懸感受態(tài)細(xì)胞 0.3ml×20 6.0ml 10.0ml

150mm×50f150mm×30 f90mm×20 f鋪固體選擇培養(yǎng)基平板

注: * 即為“構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞”

** 在不同容積的無(wú)菌離心管中進(jìn)行，a: 300或500ml;b: 50ml;c: 15ml;d: 1.5ml

文庫(kù)cDNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母感受態(tài)細(xì)胞

1. 以生長(zhǎng)于SD/-Ura，-His固體培養(yǎng)板上的含有構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA及報(bào)告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為宿主菌，制備酵母感受態(tài)細(xì)胞。

2. 將酵母宿主菌接種于5.0ml SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0ml SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。

SD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min

A. Difco Nitrogen 0.67g

B. 葡萄糖 2.00g

C. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 10.0ml

D. 20×Leu 5.0ml

E. 20×Trp 5.0ml

F. ddH2O → 100.0ml

3. 將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。

YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min

A. Polypepton 6.0g

B. bacto-Yeast Extract 3.0g

C. 葡萄糖 6.0g

D. ddH2O → 300 ml

4. 室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25ml ddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

5. 準(zhǔn)備下列試劑

1×轉(zhuǎn)化反應(yīng) 10×TE 10×LiAc 50% PEG ddH2O

lml / 800ml 100mA. 1×TE/LiAc 1.0ml 100

l 4.8ml /ml 600mB. PEG/LiAc 6.0ml 600

C. 1×TE 10.0ml 1.0ml / / 9.0ml

6. 取1.0ml用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入下列成份，振蕩混勻。

lmg） 40mA. pB42AD-Library（50-100

B. 10mg/ml lmHerring DNA*（2.0mg） 200

* 新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。

7. 加入6.0ml PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。

lm8. 加入700 DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。

9. 室溫離心2000xg×5min，盡量棄上清。

10. 以6.0ml 100mm，每稀釋度各×2），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，確定轉(zhuǎn)化效率在2×106cfu以上有效。fl稀釋不同倍數(shù)，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m1×TE重懸沉淀細(xì)胞，取10

150mm×30），30℃倒置培養(yǎng)3-5天。fl涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m11. 按每板200

SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板

A. Difco Nitrogen 13.40g

B. 葡萄糖 40.00g

C. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 200.0ml

D. 20×Leu 100.0ml

E. Agar 40.00g

F. ddH2O 150mm）f→ 2000.0ml 鋪30塊平板（

12. 在超凈工作臺(tái)上，在所有生長(zhǎng)菌落的平板上各加5ml TE（pH7.0）緩沖液，將菌落刮下。

13. 離心棄上清，加入10-20ml TE緩沖液重懸沉淀菌，加入等體積的無(wú)菌65%甘油-MgSO4緩沖液，混勻，分裝1.0ml/管，保存于4℃ 1周或-80℃1年以上。

65%甘油-MgSO4緩沖液: 65%甘油;100mM MgSO4;25mM Tris-HCl（pH8.0）

A. 甘油 65.00ml

B. MgSO4•7H2O 2.465g

C. 2.0 M Tris-HCl（pH8.0） 1.25ml

D. ddH2O → 100.00ml

酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的篩選

1. 經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)基篩選的含有DNA-BD載體、文庫(kù)DNA及報(bào)告基因的酵母感受態(tài)細(xì)胞，用無(wú)菌TE稀釋至1:104、1:106和1:108等不同濃度。

90mm），30℃倒置培養(yǎng)3-5天，計(jì)數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。fl，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板（m2. 取上述稀釋菌液各100

3. 確定待進(jìn)一步鑒定的酵母菌滴度（cfu/ml）=克隆數(shù)×105（1:104稀釋?zhuān)⒖寺?shù)×107（1:106稀釋?zhuān)┗蚩寺?shù)×109（1:108稀釋?zhuān)?/p>

4. 按照以前實(shí)驗(yàn)確定的文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率的5-10倍的總量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。

5. 挑取顯藍(lán)色的菌落，再接種于SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以進(jìn)一步確證。

SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基

A. SD/Gal/Raf 3.79g

B. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 10.0ml

C. Agar 2.00g

D. ddH2O → 85.0ml

滅菌（115℃，10lb/in2）15min ，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板

E. 10×BU 10.0ml

F. 20mg/ml X-gal 0.4ml 90-100mm）f鋪5-6塊平板（

10×BU緩沖液，121℃，15lb/in2滅菌15min

A. Na2HPO4•12H2O 9.30g

B. NaH2PO4•2H2O 3.90g

C. ddH2O → 100.0ml

20mg/ml X-Gal

A. X-Gal 40mg

B. DMF 2ml

酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的鑒定

-酵母質(zhì)粒DNA的提取

1. 挑取經(jīng)過(guò)酵母選擇/誘導(dǎo)培養(yǎng)基初步鑒定的酵母單菌落，接種于5.0-10.0ml SD/-Trp液體培養(yǎng)基，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)20hr。

SD/-Trp液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min

A. Difco Nitrogen 0.67g

B. 葡萄糖 2.00g

C. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 10.0ml

D. 20×His 5.0ml

E. 20×Leu 5.0ml

F. 20×Ura 5.0ml

G. ddH2O → 100.0ml

2. 室溫離心5000xg×1min，棄上清，收菌。

l酵母裂解液，振蕩重懸沉淀酵母菌。m3. 加入200

酵母裂解液: 2% Triton X-100;1% SDS;100mM NaCl;10mM Tris-HCl（pH8.0）;1mM EDTA

A. 10% Triton X-100 20.0ml

B. 10% SDS 10.0ml

C. NaCl 0.58g

D. Tris 0.12g

E. EDTANa2•2H2O 0.04g

F. 1.0M HCl調(diào)pH8.0

G. ddH2O → 100.0ml

4. 加入下列試劑，充分振蕩5min;液氮凍存10min，室溫復(fù)融;再充分振蕩5min。

A. 經(jīng)酸處理的玻璃珠（Sigma） 0.20g

B. 苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1） 0.2ml

5. 室溫離心12000xg×10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml 離心管中，加入下列試劑，于-70℃凍存30-60 min。

A. 3 M NaAc（1/10 lmV） 20

lmB. 無(wú)水乙醇（2.5V） 500

6. 離心12500xg×10 min，4℃，棄上清;70%乙醇洗滌沉淀，于 37℃烘箱或超凈臺(tái)干燥DNA;將干燥的沉淀DNA重溶于 l無(wú)菌ddH2O中，保存于-20℃。m20-30

酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的鑒定

-酵母質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化大腸桿菌

1. 在冰浴條件下，取待轉(zhuǎn)化DNA l感受態(tài)細(xì)胞中，混勻。mg），加入100ml（5pg-0.5m1.0

WF，200m2. 將上述混合液加入間距0.1cm的樣品杯中，電轉(zhuǎn)化（1.8kV，25 。

3. 迅速加入1ml新鮮的LB培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，37℃恒溫，150rpm振蕩孵育30-60min。

4. 將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布M9/DO（-Trp）固體培養(yǎng)板，37℃倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（16-22hr）。

5. 按常規(guī)方法擴(kuò)增上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌，堿裂解法少量抽提質(zhì)粒DNA，酶切篩選AD載體上含有插入片段的陽(yáng)性克隆，保存其于25%甘油，待進(jìn)一步驗(yàn)證。

M9/DO-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min

A. 葡萄糖 1.2g

B. Agar 6.0g

C. 5×M9緩沖液 60 ml

D. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 30 ml

E. 20×His 15 ml

F. 20×Leu 15 ml

G. 20×Ura 15 ml

H. ddH2O 165 ml

冷卻至50℃左右，加入下列成份，混勻鋪板

I. 1.0M Thiamine-HCl（Vit.B1） 0.3 ml

J. 100mg/ml Amp 0.3 ml 90-100mm）f鋪10-15塊平板（

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（電轉(zhuǎn)化）

1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的E.coli KC8單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約12-14hr）。

2. 將2.5 ml新鮮菌液接種于500ml SOB培養(yǎng)液中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6（約2.5-3hr）。

SOB液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min

A. bacto-Tryptone 10.00g

B. bacto-Yeast Extract 2.50g

C. NaCl 0.25g

D. KCl 0.09g

E. MgCl2•6H2O 1.02g

F. ddH2O → 500.0ml

3. 將培養(yǎng)菌液收集于離心管中，冰水浴15-20min。

4. 離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;以5ml 預(yù)冷的無(wú)菌ddH2O重懸沉淀菌;再加入500ml預(yù)冷的無(wú)菌ddH2O洗滌細(xì)菌。

5. 重復(fù)上述步驟1次，以充分去除培養(yǎng)基中殘余的鹽離子成份。

6. 用40-50ml 預(yù)冷的無(wú)菌10% 甘油重懸沉淀細(xì)菌，轉(zhuǎn)移至50ml 無(wú)菌離心管中;離心6000xg×10min，4℃，棄盡上清;重復(fù)此步驟1次。

7. 以等體積（約1.5-2.0ml） 預(yù)冷的無(wú)菌10% 甘油重懸上述沉淀的感受態(tài)細(xì)胞，分裝0.5ml/管（5-6次轉(zhuǎn)化反應(yīng)），保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

酵母雙雜合系統(tǒng)陽(yáng)性克隆的確證

1. 以含有報(bào)告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為轉(zhuǎn)化宿主菌。

2. 將酵母宿主菌接種于5.0ml SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0ml SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr，至OD600>1.0。

SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min

A. Difco Nitrogen 0.67g

B. 葡萄糖 2.00g

C. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 10.0ml

D. 20×His 5.0ml

E. 20×Leu 5.0ml

F. 20×Trp 5.0ml

G. ddH2O → 100.0ml

3. 將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3（約50ml），30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。

YPD液體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min

A. Polypepton 6.0g

B. bacto-Yeast Extract 3.0g

C. 葡萄糖 6.0g

D. ddH2O → 300 ml

4. 室溫離心5000xg×5min，棄上清;加入15-25ml ddH2O重懸洗滌沉淀酵母細(xì)胞，離心棄上清，沉淀用1×TE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

5. 準(zhǔn)備下列試劑

20×轉(zhuǎn)化反應(yīng) 10×TE 10×LiAc 50% PEG ddH2O

l / 1.2mlml 150mA. 1×TE/LiAc 1.5ml 150

B. PEG/LiAc 12.0ml 1.2ml 1.2ml 9.6ml /

C. 1×TE 10.0ml 1.0ml / / 9.0ml

6. 分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。

A. pLexA lmg） 3-5mor pLexA-X（0.1

lmg） 3-5mB. pB42AD-Y（0.1

C. 10mg/ml Sperm lmDNA*（0.1mg） 10

* 新配制時(shí)水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。

l用1×TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，振蕩混勻。m7. 每管加入100

lm8. 各加入600 PEG/LiAc，振蕩混勻，30℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。

lm9. 各加入70 DMSO緩和倒置混勻。42℃熱休克15min，迅速插入冰浴。

10. 室溫離心13000xg×10sec，盡量棄上清;以0.3ml 1×TE重懸沉淀細(xì)胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。

SD/-Ura，-His，-Trp固體培養(yǎng)基，115℃，10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板

A. Difco Nitrogen 3.35g

B. 葡萄糖 10.00g

C. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 50.0ml

D. 20×Leu 25.0ml

E. Agar 10.00g

F. ddH2O → 500.0ml 90-100mm）f鋪20-25塊平板（

11. 挑取上述固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的含有目的DNA（X）的pLexA-X（+）或空載pLexA（-）單菌落，分別接種SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)板，30℃倒置培養(yǎng)3-5天。

SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基

A. SD/Gal/Raf 3.79g

B. 10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 10.0ml

C. Agar 2.00g

D. ddH2O → 85.0ml

滅菌（115℃，10lb/in2）15min ，冷卻至50℃，加入下列成份后鋪板

E. 10×BU 10.0ml

F. 20mg/ml X-gal 0.4ml 90-100mm）f鋪5-6塊平板（

12. 選擇含有pLexA-X顯藍(lán)色，而相應(yīng)的不含有插入DNA的空載pLexA顯白色的克隆，擴(kuò)增其在E.coli KC8中的甘油菌，按常規(guī)抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列分析。

10×DO（-His，-Trp，-Leu，-Ura）

為不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。

每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。

（1） L-Isoleucine L-異亮氨酸 300mg

（2） L-Valine L-纈氨酸 1500mg

（3） Adenine 腺嘌呤 200mg

（4） L-Arginine HCl L-精氨酸 200mg

（5） L-Lysine HCl L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽 300mg

L-Methionine L-甲硫氨酸 200mg

（7） L-Phenylalanine L-苯丙氨酸 500mg

L-Threonine L-蘇氨酸 2000mg

（9） L-Tyrosine L-酪氨酸 300mg

20×氨基酸儲(chǔ)存液

每100ml溶液中分別含有下列成份，配制后保存于4℃。

20×His L-Histidine L-組氨酸 40mg

20×Trp L-Tryptophan L-色氨酸 40mg

20×Leu L-Leucine L-白氨酸 200mg

20×Ura Uracil 尿嘧啶 40mg

酵母轉(zhuǎn)化緩沖液:

緩沖液 體積 緩沖液配制

10×TE 100ml Tris 1.21g;EDTANa2•2H2O 0.37g;ddH2O 80ml;鹽酸調(diào)pH7.5;ddH2O定容

10×LiAc 100ml LiAc•2H2O 10.20g;ddH2O 50ml，冰醋酸調(diào)pH7.5;ddH2O定容

50% PEG 100ml PEG3350 50.0g;ddH2O定容

其它緩沖液:

緩沖液 體積 緩沖液配制

TE 1000ml Tris 1.21g;EDTANa2•2H2O 0.37g;ddH2O 800ml;鹽酸調(diào)pH;ddH2O定容

STE 1000ml NaCl 5.84g;Tris 1.21g;EDTANa2•2H2O 0.37g;ddH2O 800ml;鹽酸調(diào)pH8.0;

ddH2O定容

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