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酵母質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)化大腸桿菌詳細(xì)步驟和注意事項(xiàng)
最近更新時(shí)間：2013-4-6
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>24.3KB
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詳細(xì)步驟:
1、挑10mm2的酵母溶于含50μl的TE （ pH7.0） 的1.5ml離心管中.
2、每管加10μl的裂解液（Lyticase 5 unit/μl, sigma避光保存）,渦流混勻.
3、37℃,200-250r/m,30-60min.
4、每管加10 μl 20%SDS,渦流1min.
5、–20℃凍存過夜.
6、室溫下融解后,渦流混勻.
7、質(zhì)粒提取.
7.1 1.5ml離心管加TE Buf至200μl的（pH7.0）
7.2 200μl酚,渦流5min后,4℃,14000r/m離心10min.
7.3 取上清至干凈的1.5ml Eppendorf管中.
7.4 等體積酚氯仿,渦流5min.
7.5 4℃,14000r/m離心10min.
7.6 取上清至一干凈的1.5ml Eppendorf管后加等體積氯仿,渦流混勻.
7.7 4℃,14000r/m離心10min.
7.8 取上清至一干凈的1.5ml Eppendorf管中.
7.9 8μl 10M NH4Ac和500μl 95%～100%的乙醇.
7.10 –70℃,1h.
7.11 4℃,14000r/m離心10min.
7.12 棄上清,空氣中干燥.
7.13 10μl H2O懸浮細(xì)胞.
8、轉(zhuǎn)化（要求:4℃預(yù)冷）
8.1 冰上融化感受態(tài)細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)胞的制備見分子克隆啦）*0f’.
8.2 加100μl轉(zhuǎn)化細(xì)胞到預(yù)冷的1.5ml離心管中,槍頭輕輕吹打混勻.
8.3 冰上孵育30min.
8.4 42℃,45S～50S.
8.5 冰上孵育2min后,加1ml LB.
8.6 37℃,1h,250r/m.
8.7 2500r/m,5min,RT.
8.8 棄上清,在剩余的溶液中懸細(xì)胞.
8.9 接種LB/Amp板,37℃,倒置培養(yǎng)24h.
8.10 挑克隆,過夜培養(yǎng),常規(guī)堿裂解法提質(zhì)粒