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提取高質(zhì)量RNA技巧
最近更新時(shí)間：2013-4-8
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1.迅速滅活內(nèi)源的RNA酶，以防止RNA降解。
以下3個(gè)方法均可有效使內(nèi)源RNA酶失活：
1）用含離液（如胍鹽）的細(xì)胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。
2）用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結(jié)，以確保瞬間令RNA酶失活。
3）立即將樣品置于RNAfixer無(wú)液氮RNA樣品儲(chǔ)存液中。它是一種水相、無(wú)毒的收集試劑，能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的RNA。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片一定要夠?。?lt;0.5 cm），這樣RNAfixer才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。
2.使用正確的細(xì)胞或組織儲(chǔ)存條件
在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后，應(yīng)該儲(chǔ)存在-80°C，千萬(wàn)不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會(huì)導(dǎo)致RNA的降解和損失。瞬間凍結(jié)的組織應(yīng)該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。
RNAfixer使樣品儲(chǔ)存更為便利。儲(chǔ)存在RNAfixer中的細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)星期，在4°C可穩(wěn)定保存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月，或*保存在-20°C。RNAfixer說(shuō)明書下載.
3. 破壁方法
細(xì)胞或組織的*勻漿對(duì)RNA提取來(lái)說(shuō)，是一個(gè)很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來(lái)選擇。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞可以置于細(xì)胞裂解液中，通過(guò)簡(jiǎn)單的渦旋震蕩來(lái)勻漿;而動(dòng)物組織、植物組織、酵母和細(xì)菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨。比如說(shuō)細(xì)菌（特別是革蘭氏陽(yáng)性菌）的細(xì)胞壁，就需要溶菌酶消化來(lái)實(shí)現(xiàn)*的細(xì)胞裂解和RNA的zui大回收。酵母和革蘭氏陽(yáng)性菌通常還需要液氮研磨過(guò)程中加入玻璃微珠幫助破壁，酵母提取也可以加入諸如Lyticase等破壁酶幫助破壁，再用TRIpure或RNApure進(jìn)行提取。
4. 選擇的RNA分離方法
現(xiàn)有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前zui簡(jiǎn)單也是zui安全的方法是柱式分離，如RNApure 因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單，時(shí)間短，純度高而受到大家的喜愛，RNApure不需要DNA酶消化DNA，節(jié)省了時(shí)間，避免RNA的降解，從而提高了產(chǎn)量;相對(duì)非柱式分離（如TRIZOL），去除蛋白及其他雜質(zhì)干凈，提高了純度，對(duì)于細(xì)胞、組織、一般植物均非常適合。植物RNA的提取比較難抉擇，植物RNA提取受酚、多糖、蛋白雜質(zhì)、次生代謝物含量的影響，一般用TRIZOL提取純度不高，而且很多植物用TRIZOL提取不出來(lái)。這時(shí)候可以選擇多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（水仙、辣椒、胡蘿卜、玉米、百合、小麥、西紅柿、花菜、油菜等）和通用植物RNA提取試劑盒（適合絕大多數(shù)植物提取，包括：蘋果、葡萄、草莓、香蕉、龍眼、荔枝、草坪植物、松樹、杉樹、白樺、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉榕、紫羅蘭、月季、天竺藍(lán)、牽?；ǖ龋?非常值得一提的是血液（包括血清、血漿、腦脊液、其他液體）RNA的提取用TRIZOL和紅細(xì)胞裂解的方法效果都不好，紅細(xì)胞裂解液不含有RNA酶的抑制成分，這個(gè)過(guò)程RNA很容易降解，推薦使用TRIpure LS 或者血液總RNA提取試劑盒。
5.消除環(huán)境RNase的污染
為了得到完整的、高品質(zhì)RNA，在整個(gè)RNA制備過(guò)程中，當(dāng)RNA離開強(qiáng)蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護(hù)時(shí)，避免引入新的RNase污染就非常關(guān)鍵。由于RNase幾乎是*，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣?xùn)|西都是無(wú)RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作臺(tái)、玻璃器皿和制膠設(shè)備，都必須用表面去污凈化溶液如RNase噴霧清除劑 來(lái)處理過(guò)，去除各種溶液或者反應(yīng)緩沖液中可能存在的RNase污染，可以用RNAsafe。必須保證一直使用無(wú)RNase的槍頭、試管和溶液，手套也應(yīng)經(jīng)常更換。
6.低濃度RNA的沉淀
純化得到的RNA可能需要通過(guò)沉淀來(lái)濃縮，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。醋酸銨（NH4OAc） 沉淀（加0.1體積的5 M 醋酸銨、2-2.5體積的無(wú)水乙醇，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA ）的方法。核酸助沉劑是linear acrylamide，當(dāng)RNA用于RT-PCR分析時(shí)，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因?yàn)樗鼈兌疾缓珼NA污染，糖原含量高會(huì)抑制PCR反應(yīng)。酵母RNA和未處理的糖原會(huì)給樣品帶來(lái)核酸污染，有可能影響RT-PCR的結(jié)果。沉淀后，注意避免RNA沉淀過(guò)分干燥，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致很難重新溶解。
7.提取好的RNA如何儲(chǔ)存
如果只是短期儲(chǔ)存，重懸的RNA應(yīng)放置于-20°C;如果是長(zhǎng)期儲(chǔ)存的話，就應(yīng)該放置于-80°C。盡管重懸于水或緩沖液中的RNA也可以儲(chǔ)存在-80°C，但保存RNAlong中的RNA沉淀則更加穩(wěn)定，可以長(zhǎng)期保存。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會(huì)避免反復(fù)凍融損傷RNA，并預(yù)防偶然的RNase污染。