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如何用PVDF Elispot法檢測(cè)人IFNγ
點(diǎn)擊次數(shù)：1026 發(fā)布時(shí)間：2013-7-29
試劑盒內(nèi)容：PVDF96孔板，室溫保存;0.1ml捕獲抗體，4℃保存;0.1ml生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，4℃保存;15ul親和素堿性磷酸酶標(biāo)，4℃保存;0.25g牛血清白蛋白，4℃保存;0.25g脫脂乳，4℃保存;11ml底物緩沖液，4℃保存;11ml濃縮PBS（10X），室溫保存;11ml濃縮洗滌液（200x），室溫保存
自備材料/試劑： 細(xì)胞培養(yǎng)液，CO2孵育箱，70%酒精
直接的和間接的Eli-spot法
可在已包被抗體的孔中直接刺激細(xì)胞（直接法），或在24孔板或燒瓶中先刺激細(xì)胞，然后放入已包被的孔中（間接法）。使用哪種方法基于：1）檢測(cè)細(xì)胞的類型;2）希望得到的細(xì)胞量。如果只需少量的細(xì)胞因子生成細(xì)胞，使用直接法;如果細(xì)胞因子生成細(xì)胞較多，使用間接法。其它步驟一致。
刺激方法：建議用PMA和婁諾霉素刺激PBMC，使其產(chǎn)生IFNγ。
在培養(yǎng)液中稀釋PBMC（如：RPMI 1640加2mM谷氨酸鹽和10%加熱失活的小牛血清），其中含1ng/ml PMA和500ng/ml婁諾霉素（Sigma, Saint Louis, MO）。加2.104至5.104個(gè)細(xì)胞到抗體包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小時(shí)。其它的刺激劑孵育時(shí)間可能不同，基于細(xì)胞因子生成細(xì)胞的量，按不同情況作*選擇。
試劑的準(zhǔn)備：1. 10ml磷酸緩沖鹽（PBS，10X）以90ml蒸餾水稀釋;2. 0.22g脫脂乳用11ml稀釋的PBS溶解，zui終濃度為2%;3. 0.22gBSA溶解于22ml已稀釋的PBS，zui終濃度為1%;4. 10ml濃縮洗滌液（200x）以1990ml蒸餾水稀釋;5. 10ul親和素堿性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀釋6. 7ml酒精以3ml蒸餾水稀釋，zui終濃度為70%。
Eli-spot操作過程：
1. 用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。
2. 倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。
3. 3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul， 蓋上板蓋，4℃過。
4.倒去液體，100ul PBS洗滌一次。
5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS（見試劑準(zhǔn)備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時(shí)。
6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
7.用100ul PBS洗滌一次。
8.每孔加入100ul細(xì)胞懸浮液（含適當(dāng)量的細(xì)胞和相應(yīng)濃度的刺激劑）。細(xì)胞可預(yù)先在體外接受刺激（間接Eli-spot）。蓋上標(biāo)準(zhǔn)的96孔板塑料板蓋，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時(shí)間（15-20小時(shí)）。這期間不要晃動(dòng)或移動(dòng)孔板。
9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。
11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測(cè)抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時(shí)30分。
13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時(shí)。
15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘。*顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中。
18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時(shí)，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點(diǎn)數(shù)。4℃下放置一夜，點(diǎn)會(huì)比較明顯。
此板在室溫下避光保存。
使用時(shí)應(yīng)注意BCIP/NBT緩沖液是潛在的至癌物質(zhì)，試驗(yàn)時(shí)帶手套，使用后適當(dāng)處理。對(duì)MAIPAN4510板，孵育時(shí)由于毛細(xì)作用，試劑滲入膜中，此液體難以洗去，因此導(dǎo)致背景增加。為了避免此情況，建議在步驟12時(shí)將板底移去，將膜倒轉(zhuǎn)，用蒸餾水流沖洗，同時(shí)用洗滌緩沖液按正常的步驟洗滌。在步驟14中，由于板底已移去，建議將MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步驟不變。