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如何使用酶聯(lián)免疫法法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)
點(diǎn)擊次數(shù)：729 發(fā)布時(shí)間：2013-8-5
二、實(shí)驗(yàn)原理
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。免疫酶技術(shù)是將酶標(biāo)記在抗體/抗原分子上，形成酶標(biāo)抗體/酶標(biāo)抗原，稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體。ELISA法是免疫酶技術(shù)的一種，其特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板（或球）吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都在其中進(jìn)行。在每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌，這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系，也避免了末反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA法中。酶促反應(yīng)只進(jìn)行一次，而抗原、抗體的免疫反應(yīng)可進(jìn)行一次或數(shù)次，即可用二抗（抗抗體）、三抗再次進(jìn)行免疫反應(yīng)。
目前常用的幾種ELISA方法有：測(cè)定抗體的間接法，測(cè)定抗原的雙抗體夾心法和測(cè)定抗原的競(jìng)爭(zhēng)法等。本實(shí)驗(yàn)采用間接法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)。其主要過程為：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板的凹孔內(nèi)，加待測(cè)抗體，保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，加酶標(biāo)抗抗體，保溫后洗滌，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿終止酶促反應(yīng)，用目測(cè)或光電比色測(cè)定抗體含量。
三、儀器、原料和試劑
儀器
聚苯乙烯96孔酶標(biāo)板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。
原料
單克隆抗體
試劑
1、抗原及酶標(biāo)記抗體
①抗原：兔抗人IgG（RabbitAanti-humanIgG，CodeNo.A0423）;
②酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP（RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo.P0260）;均為DAKO公司產(chǎn)品，使用時(shí)按照說明書要求稀釋。
4、洗滌液（含0.05%Tween20的PBS）：1LPBS中加入Tween-20500μL.
5、封閉液（含1%牛血清白蛋白，0.1%Tween20的PBS）：10mLPBS中加入100mgBSA，10μLTween-20.
6、底物溶液
①磷酸鈉鹽緩沖液（0.1mol/LpH6.0）：稱Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL.
②TMB貯液：稱60mgTMB溶于10mL二甲基亞砜中，4℃避光保存。
③底物應(yīng)用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB貯液10μL.30%H2O215μL，混勻。
7、終止液：2mol/LH2SO4
四、操作步驟
①抗原包被：兔抗人IgG作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板
中。4℃放置過。
②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。
③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h.
④洗滌：用洗滌液洗3次。
⑤加待測(cè)樣品（一抗）：將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清在另-塊板上用PBS連續(xù)稀釋（按照1：2或1：10），100μL/孔加到已包被的板上，每個(gè)樣品平行做兩份，PBS或空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，已知樣品作為陽性對(duì)照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h.
⑥洗滌：用洗滌液洗3次。
⑦加酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l：8000稀釋，100μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。
⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。
⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍(lán)色。
⑩終止反應(yīng)、比色：加50μL/孔終止液。顏色變黃;用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處各孔的吸光值，陽性反應(yīng)的zui大稀釋度為待測(cè)樣品的效價(jià)。