1 固定和取材

組織切片的固定劑主要為甲醛和酒精，固定劑可與蛋白質(zhì)交聯(lián)結(jié)合、使之變性，組織硬化、結(jié)構(gòu)固定,此外其本身的變性物質(zhì)可與染料結(jié)合，增強(qiáng)著色能力。同時(shí)，固定交聯(lián)和沉淀蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分，產(chǎn)生不同的折光率，使得光學(xué)顯微鏡下易于更清晰地觀察組織細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)。

1.1 減少或去除組織切片中甲醛顆粒

甲醛飽和液偏酸，影響細(xì)胞核的染色，特別是放置較久后，易析出沉積在組織切片中，呈細(xì)小的黑褐色或黃黑色顆粒物，影響觀察。以甲醛飽和液和pH7.2 的PBS 緩沖液配制的10%中性甲醛固定液（ 體積比為1∶9） 應(yīng)用zui普遍，效果也相對(duì)較好，可以減少和消除甲醛顆粒。如果現(xiàn)場(chǎng)無(wú)法配制PBS 緩沖液，可在固定溶液中加入一些普通粉筆，使溶液呈中性或弱堿性。甲醛顆粒易于出現(xiàn)在血液和血漿分布區(qū)，以及自然腐敗較重的組織，可作為組織出血和血漿滲出指示劑。

1.2 防止組織固定不良

固定液過(guò)濃或過(guò)稀釋?zhuān)瑵B透組織的能力就差，組織固定不均勻，出現(xiàn)中央?yún)^(qū)組織固定不良。不僅取材時(shí),組織軟硬不均，切面不平整，影響切片時(shí)修平組織觀察面，組織固定不良還會(huì)影響脫水、浸蠟、染色等效果（ 表1） 。一般固定液與檢材體積比為1∶10 左右為宜，器官組織*浸泡于固定液中，固定時(shí)間3～7 d。自溶腐敗嚴(yán)重組織檢材固定時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)幾天，或增加固定液中甲醛濃度（ 可按1∶8 比例配制） 。環(huán)境寒冷時(shí)，亦應(yīng)適當(dāng)增加固定液濃度。

固定液每天浸透組織約2～3mm，為快速*固定組織檢材，腦、肝、肺、心、腎、脾等較大器官，均應(yīng)切開(kāi)后再固定。全腦應(yīng)線(xiàn)繩懸吊固定（ 普通病理檢驗(yàn)，先正中矢狀切開(kāi)胼胝體后固定，可加速全腦固定） ，心應(yīng)常規(guī)切開(kāi)各房室腔，肺和腎應(yīng)分別從zui大外緣向肺門(mén)和腎門(mén)正中切一刀，肝、脾常規(guī)平行長(zhǎng)軸切成2～3 cm厚片，再予固定。如果固定的器官較大、容器較小或固定液較少時(shí)，應(yīng)于固定3 d 內(nèi)，翻動(dòng)器官或更換固定液，以免大器官貼壁面壓平和固定不良。

1.3 避免組織切片厚薄不均和不規(guī)則腔隙

取材一般在解剖之后3～7 d 進(jìn)行，取材時(shí)要刀快手穩(wěn)，切面平整，厚度3～5mm，避免組織塊厚薄不均、觀察面不平整，檢材組織塊大小應(yīng)略小于所選用的蓋玻片1～2mm，以便封膠*。組織塊記號(hào)紙應(yīng)為70 g以上的復(fù)印紙，必須碳素筆標(biāo)記，以免筆跡被脫水透明掉。組織塊應(yīng)流動(dòng)自來(lái)水充分沖洗12 h 以上，盡量洗掉和稀釋殘留的甲醛溶質(zhì)和顆粒。

2 脫水、透明、浸蠟和包埋

2.1 脫水和透明

脫水和透明是影響切片質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，要保證脫水的*而又不過(guò)度。首先要保證梯度酒精試劑的濃度、容量，要及時(shí)更換。脫水不*導(dǎo)致透明時(shí)無(wú)法置換組織中水分，浸蠟不*，切片時(shí)組織中間出現(xiàn)松軟空洞，攤片時(shí)切片容易散開(kāi)，染色時(shí)易于脫片、著色不良，蠟塊縮水。脫水時(shí)要根據(jù)不同的組織、大小、年齡，以及動(dòng)物的標(biāo)本，調(diào)整各步時(shí)間。由于丙酮易揮發(fā)，要經(jīng)常更換，以保持濃度。脫水過(guò)度組織塊變硬,切片時(shí)易于碎裂。

2.2 浸蠟

*缸石蠟中加入少量二甲苯或低熔點(diǎn)軟蠟，zui后一缸浸蠟和包埋的石蠟的熔點(diǎn)要相同，不然組織與石蠟不能緊密結(jié)合，攤片時(shí)易解離。浸蠟的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則易造成組織塊脆硬，切片如豆腐渣樣。

2.3 包埋

包埋的石蠟應(yīng)預(yù)先溶解一段時(shí)間，以保證石蠟密度均勻，初熔石蠟中含有雜質(zhì)，應(yīng)去除沉淀或絮狀雜質(zhì)，保證石蠟干凈、致密，利于切片。應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)調(diào)整包埋蠟的熔點(diǎn)，冬季用56～58 ℃低熔點(diǎn)蠟，夏秋季用60～62 ℃高熔點(diǎn)蠟。包埋時(shí)蠟缸溫度不超過(guò)70 ℃，防止石蠟揮發(fā)，污染環(huán)境。

3 切片、攤片、烤片

3.1 切片

環(huán)境溫度高時(shí)，切片前可將蠟塊放入冰箱冷藏柜預(yù)冷30min。剛包埋好的熱蠟塊不能立刻冷凍，速冷會(huì)造成蠟塊裂痕，組織塊易碎。在刀架上放置組織蠟塊時(shí)，應(yīng)注意組織塊包埋方向、組織層次等，使纖維和肌肉走向與切片刀刃平行，較難切的組織部分應(yīng)放在上面，如皮膚表皮、包膜、胃腸道漿膜等，以減少組織斷裂現(xiàn)象。操作切片機(jī)時(shí)應(yīng)用力均勻，避免用力過(guò)重。脫鈣的組織、骨髓，以及鈣化組織，應(yīng)選用固定刀口,以減少刀刃過(guò)多的缺口。用毛筆展片時(shí)，要防止筆絲進(jìn)入刀口，以免增加刀刃缺口。為了減少刀片損耗，修片時(shí)用已經(jīng)舊刀片，切片時(shí)用新刀片，保持新刀片刃鋒利、不粘蠟，避免切片皺褶和刀痕。刀刃有缺口時(shí)，切片出現(xiàn)豁口，刀刃鈍時(shí),切片皺褶、易碎，應(yīng)及時(shí)更換刀口位置或刀片。蠟塊夾不緊或刀片變鈍時(shí)，易刀，應(yīng)重新調(diào)整夾板或更換刀片。切片時(shí)，動(dòng)作要輕柔，用力均勻，避免切片厚薄不均。每切一個(gè)蠟塊都應(yīng)該把切片刀和刀架的碎片都清理干凈，避免組織間的相互污染。如遇難切的蠟片時(shí)，可用與蠟塊切面大小相仿的薄紙潮濕后貼蠟塊表面上切片，然后將附有切片一面朝上放入水中漂片。切片不完整、皺縮或卷片，可能刀不快或切片角度不對(duì)，一旦調(diào)準(zhǔn)*切片角度和磨刀角度（ 傳統(tǒng)的大切片刀） 后不要隨意改變。

3.2 攤片

攤片的水溫一般為40～45 ℃。攤片時(shí)動(dòng)作要?jiǎng)蛩佥p柔，避免皺褶和產(chǎn)生氣泡。水溫過(guò)高時(shí)，切片易離散。出現(xiàn)小氣泡時(shí)，可用眼科鑷在水下小心地移除氣泡，以減少脫片和組織破損的機(jī)會(huì)。室溫低時(shí)，撈片時(shí)將載玻片放入水中片刻，防止切片褶皺而導(dǎo)致脫片。

3.3 烤片

烤片溫度應(yīng)為70℃左右，烤片時(shí)間不少于30min。溫度過(guò)高和時(shí)間太長(zhǎng)，組織易干固、皺縮，折光增強(qiáng)。

4 染色、封片、歸檔

染色過(guò)程中，首先應(yīng)保證各種試劑的濃度、體積,不能有沉淀。用Harris 蘇木精液時(shí)，染色前要先用一張濾紙除去液體表面的結(jié)晶，以免污染切片。脫蠟*，不然易出現(xiàn)嗜堿性片狀模糊，毛玻璃樣現(xiàn)象，染色不均。嚴(yán)格控制酒精梯度時(shí)間，以免水分過(guò)快進(jìn)入細(xì)胞，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響染色效果。染色時(shí)調(diào)節(jié)pH 值很重要，在甲醛溶液中固定時(shí)間長(zhǎng)的組織塊，組織酸化而影響細(xì)胞核著色，故應(yīng)自來(lái)水沖洗時(shí)間長(zhǎng)一些或在稀氨水中處理1～2min，以使細(xì)胞核著色較深[4]。胞漿伊紅著色不佳時(shí)，可在伊紅溶液中滴加1～2滴冰醋酸。脫蠟之后，在無(wú)水乙醇中時(shí)間要足夠長(zhǎng)，以*洗去二甲苯。嚴(yán)格控制分化時(shí)間，在顯微鏡下觀察分化效果，一般以細(xì)胞核染色清晰而細(xì)胞質(zhì)基本無(wú)色為佳。如果過(guò)分延長(zhǎng)分色時(shí)間將導(dǎo)致染色太淺，應(yīng)重新染色后再行分色。鹽酸酒精分化之后沖水時(shí)間不少于5min，盡可能洗去胞質(zhì)中蘇木素染液，增強(qiáng)返藍(lán)效果，使背景不過(guò)多染色。染色過(guò)程中不要讓切片干枯，以免切片收縮、變形，影響細(xì)胞形態(tài)。切片經(jīng)酒精脫水后，入二甲苯時(shí)出現(xiàn)白色不透明狀態(tài)，脫水不*，應(yīng)更換酒精、二甲苯，將切片退回*，重新*脫水與透明。透明*的切片顯得干凈、透亮便于觀察。封片樹(shù)膠濃度要適中，過(guò)稀易出現(xiàn)大氣泡、溢膠污染切片，影響觀片。過(guò)稠易出現(xiàn)后薄不均、折光差，及細(xì)小氣泡。封固過(guò)程中，直接從二甲苯中取出封片,保持二甲苯不揮發(fā)，避免組織大片破裂。切片封固后應(yīng)放置一段時(shí)間，樹(shù)膠完固后，才能歸檔，以免溢膠切片相互粘連重疊。根據(jù)環(huán)境溫濕度，一般應(yīng)放置7～15 d。歸檔切片應(yīng)放置干燥避光處，避免切片褪色。