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士鋒生物考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理、步驟及注意事項(xiàng)
點(diǎn)擊次數(shù)：831 發(fā)布時(shí)間：2013-8-28
蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的方法有很多，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)室zui常見(jiàn)的一種方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作簡(jiǎn)便，下文介紹了考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、操作以及注意事項(xiàng)。
實(shí)驗(yàn)原理
考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的zui大吸收峰（lmax）的位置，由465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
考馬斯亮藍(lán)染色法的突出優(yōu)點(diǎn)是：
（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其zui低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。
（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性。因而*不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。
（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。
此法的缺點(diǎn)是：
（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)通常選用g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。
（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）等。
試劑與器材
一、試劑
考馬斯亮藍(lán)試劑：
考馬斯亮藍(lán)G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL。
二、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液
1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液
結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
2.待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。
人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀釋200倍。
三、器材
試管1.5×15cm（×6），試管架，移液管管0.5mL（×2）;1mL（×2）;5mL（×1）;恒溫
水浴;分光光度計(jì)。
操作方法
一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
取7支試管，按下表平行操作。
| 試管編號(hào) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（mL） | 0 | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 |
| 0.15mol/L NaCl（mL） | 0.1 | 0.09 | 0.08 | 0.07 | 0.06 | 0.05 | 0.04 |
| 考馬斯亮藍(lán)試劑（mL） | 5mL | ||||||
| 搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色 | |||||||
| A595nm | &NBSp; | &NBSp; |
| ||||
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
二、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的A595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。
注意事項(xiàng)
在試劑加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是zui穩(wěn)定的。
測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。
利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用，重復(fù)測(cè)定吸光度時(shí)，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的時(shí)候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是從低濃度到高濃度測(cè)定，防止誤差。