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公司動態(tài)
士鋒生物蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作方法
點擊次數(shù)：630 發(fā)布時間：2013-9-12
【材料與試劑】
（1）2×SDS凝膠加樣緩沖液
（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳槽和電泳儀
（3）加樣器和吸頭等
（4）水浴鍋
【操作方法】
（1） 把上述處理的樣品按1:1（V/V）與2×SDS凝膠加樣緩沖液混合，100℃加熱3分鐘，使蛋白質(zhì)變性;
（2） 取出變性蛋白質(zhì)，立即放于冰上。樣品如粘稠可進行超聲對DNA進行剪切，以zui大功率處理0.5～2分鐘應能有效地將裂解液粘稠度降至可控水平（注意：此步驟一定要在冰上進行）;
（3） 如有沉淀以10 000g將樣本4℃離心10分鐘，將上清液移至另一管中，棄去沉淀物;
（4） 計算使用Western印跡法檢測靶蛋白所需要的樣本量，一般Western印跡法技術檢測中等大小蛋白的檢出下限約為1～5ng。在厚0.75mm的SDS聚丙烯酰胺凝膠上，每個泳道可加樣100μg而不致過多;
（5） 用玻璃微量進樣器按順序加樣，注意沿加樣孔底上樣，否則樣品容易漂走。加樣量不宜過多或過少，一般15～20ul為宜。沒上樣的加樣孔中加1?SDS凝膠加樣緩沖液;
（6） 用注射器排除兩玻璃板底部的氣泡，將電泳裝置接通電源（正極接下槽，負極接上槽），凝膠上所加電壓為8v/cm,當溴酚藍前沿進入分離膠后，電壓可提高到15V/cm,繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部（約4小時），關閉電源;
（7） 從電泳裝置上卸下玻璃板，放入一瓷盤中，用一注射器吸取若干毫升電泳緩沖液，將針頭插入一玻璃板與凝膠之間，小心不要將凝膠刺破，沿玻璃板從左至右注入電泳緩沖液，將玻璃板與凝膠分開?？拷筮吳腥ヒ唤且詷嗣髂z的位置;
（8） 如不需做免疫檢測可直接用考馬斯亮藍染色，做免疫檢測可按以下步驟進行。