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士鋒生物Western實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參基因的選擇及使用方法
點(diǎn)擊次數(shù)：737 發(fā)布時(shí)間：2013-9-17
在Western Blotting實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種。
*種是超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法，只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可;
第二種是普通內(nèi)參，當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)，然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測(cè)。
第三種，當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠?，使?nèi)參蛋白與目的蛋白分開(kāi)，然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育，二抗溫育以及顯色。
常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我們選擇內(nèi)參與要檢測(cè)的目的蛋白的分子量相差5KD以上。因此你要知道你檢測(cè)的蛋白的分子量來(lái)選擇合適的內(nèi)參!
actin即肌動(dòng)蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin（β- non-muscle）和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來(lái)就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論的。beta-actin作為內(nèi)參是得到了*的，這是針對(duì)大多數(shù)組織和細(xì)胞來(lái)說(shuō)的，它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，表達(dá)量非常豐富。盡管zui近有一些文章已經(jīng)開(kāi)始質(zhì)疑beta-actin作為內(nèi)參的有效性（好像是對(duì)于上樣量>20ug的蛋白區(qū)分能力下降，記不清楚了），但是發(fā)文章應(yīng)該還是沒(méi)有問(wèn)題的。至于其他的內(nèi)參也是可以考慮用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，而tubulin和actin類(lèi)似，是細(xì)胞骨架的組成部分，但是不是肌肉的主要成分，應(yīng)該是一個(gè)代替品。三種同時(shí)發(fā)生變化的情況很少，需要具體分析。一旦出現(xiàn)上述三種內(nèi)參同時(shí)發(fā)生變化，如果是總蛋白可以用胞核的內(nèi)參如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至線粒體的內(nèi)參來(lái)代替，當(dāng)然一般這種可能性出現(xiàn)的幾率微乎其微。
不同異構(gòu)體表達(dá)對(duì)蛋白的檢測(cè)是有很大的影響，買(mǎi)抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗體雜不出條帶其實(shí)未必是抗體質(zhì)量的問(wèn)題。很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以zui常用的beta-actin為例，有的公司選擇N-端，有的選擇C-端。選用N- 端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作為抗原制備抗體（單抗和多抗）的占大多數(shù)，主要有santa cruz（Cat# sc-69879）,sigma（Cat# A1978等），ProSci（Cat# 3779）,Cell Signaling（Cat#4967），Axxora PLATFORM（BET-A300）等，這類(lèi)抗體均不能檢測(cè)心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體的主要有 Axxora PLATFORM（PSC-3777），EPITOMICS（1784-1,1854-1等），這類(lèi)抗體可以在肌肉細(xì)胞中檢測(cè)到actin陽(yáng)性信號(hào)。有時(shí)候在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)內(nèi)參時(shí)產(chǎn)生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對(duì)造成的。
actin幾種異構(gòu)體存在組織分布特異性，不同型actin之間具有較高的序列相似性（>90%）。β-actin是分布于非肌細(xì)胞中的一種骨架蛋白，選擇作β-actin內(nèi)參時(shí)首先得保證是組織廣泛表達(dá)的（尤其是做蛋白的組織表達(dá)譜時(shí)）。那么制備β-actin抗體的抗原應(yīng)該是選用與actin其它異構(gòu)體一致的氨基酸序列。公司制備抗體是選用beta-actin的某一段小短肽作為免疫原，可能會(huì)因?yàn)檫x取的短肽在不同型actin之間保守與否,而導(dǎo)致所制備抗體具有一定的組織特異性.如選取的短肽僅在beta型存在,所得抗體就僅能檢測(cè)非肌細(xì)胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在,則此抗體除非肌細(xì)胞外,還可以檢測(cè)cardiac，skeletal，smooth muscle細(xì)胞的actin。
Western Blot實(shí)驗(yàn)中選擇內(nèi)參作為參照體系對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析具有很好的說(shuō)明性。內(nèi)參的選擇往往使用一些常見(jiàn)的持家基因，常用蛋白內(nèi)參有GAPDH、beta-actin等。Western Blot實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參的選擇及其使用方法都會(huì)直接影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。