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士鋒生物如何進(jìn)行重組子的轉(zhuǎn)化和選擇陽(yáng)性克隆
點(diǎn)擊次數(shù)：807 發(fā)布時(shí)間：2013-10-14
一. 概念
1.transFORMAtion
特指以質(zhì)粒dna或以它作為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。
2.transfection
指噬菌體、病毒或以它們作為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程。
3.感受態(tài)與致敏過(guò)程
細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)，用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作叫致敏過(guò)程。
二.轉(zhuǎn)化方法
1.化學(xué)轉(zhuǎn)化法
細(xì)菌處于0 ℃，在CaCl2低滲溶液（0.1M）中，菌體細(xì)胞膨脹成球形，DNA則與CaCl2形成抗Dnase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42 ℃短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，重組子的基因在被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。
2.電轉(zhuǎn)化法
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備一定濃度的細(xì)胞懸液（在低離子濃度狀態(tài)以10%甘油制備），4℃條件下，以高壓脈沖電擊細(xì)胞，使細(xì)胞攝取外源DNA，電轉(zhuǎn)化法不需制備感受態(tài)細(xì)菌，操作簡(jiǎn)便，適用于各種菌株的轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)109-1010，轉(zhuǎn)化率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖時(shí)間長(zhǎng)度及DNA的濃度影響。該法缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化細(xì)胞受電場(chǎng)作用后活性受到一定影響。
3.感受態(tài)細(xì)胞及特點(diǎn)
受體細(xì)胞處于感受態(tài)是轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵之一。感受態(tài)是指細(xì)胞處于zui適于攝取和容忍外來(lái)DNA的生理狀態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞特點(diǎn)為：
（1）細(xì)胞表面暴露出一些可接受外來(lái)DNA的位點(diǎn)（以溶菌酶處理，可促使受體細(xì)胞的接受位點(diǎn)充分暴露）。
（2）細(xì)胞膜通透性增加（用鈣離子處理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞）。
（3）受體細(xì)胞的修飾酶活性zui高，而限制酶活性zui低，使轉(zhuǎn)入的DNA分子不易被切除或破壞。
（4）受體細(xì)胞本身處于非生長(zhǎng)繁殖階段（即受體細(xì)胞染色體相對(duì)穩(wěn)定）。
（5）不存在載體的篩選基因，多采用限制酶陰性、修飾酶陽(yáng)性的大腸桿菌作為受體細(xì)胞。
三.篩選
在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，并非每個(gè)宿主細(xì)胞都被轉(zhuǎn)化，即使獲得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，也并非都含目的基因，可能含有自身形成環(huán)狀的在體分子，一個(gè)載體與兩個(gè)外源DNA形成的重組子，或插入的非目的基因與載體形成的重組子等。因此轉(zhuǎn)化后須在不同層次、不同水平上進(jìn)行篩選，以區(qū)別轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子，以及鑒定所需的特異性重組子。
（一）根據(jù)重組子的遺傳學(xué)特性篩選（平板篩選）
1.抗生素平板篩選
克隆載體具有抗生素抗性基因，如：Amp、Ter、Kan等。外源基因插在抗性
基因之外，這個(gè)重組子轉(zhuǎn)化入宿主后，宿主就具有了抗生素抗性，因而在含抗生素的培養(yǎng)基中，只有陽(yáng)性重組子才能生長(zhǎng)。但有些單酶切的情況下，連接時(shí)有可能出現(xiàn)反向連接或自身環(huán)化，所以還需要進(jìn)行酶切鑒定。
2.插入失活
pBR322含有Tetr及Ampr，插入Tet后變成Tets及Ampr。
3.插入表達(dá)
如質(zhì)粒pTR262帶有負(fù)調(diào)控Tetr基因的cI基因，cI基因表達(dá)產(chǎn)物可抑制Tetr表達(dá)。當(dāng)目的基因插入cI基因后，使后者失活，Tetr表達(dá)，因此重組子在含有Tet的平板上可生長(zhǎng)，自身環(huán)化的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞則不能生長(zhǎng)。
4.營(yíng)養(yǎng)素依賴表型
把亮氨酸自養(yǎng)型載體轉(zhuǎn)入亮氨酸異養(yǎng)型菌株即可在無(wú)亮氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
5.藍(lán)白篩選
藍(lán)白篩選是通過(guò)插入失活lacZ基因，破壞重組子與宿主之間的ɑ-互補(bǔ)作用來(lái)鑒別重組子與非重組子的篩選方法，是攜帶lacZ基因的許多載體的篩選優(yōu)勢(shì)。這些載體包括M13噬菌體，pUC質(zhì)粒系列，pEGM質(zhì)粒系列等。它們的共同特點(diǎn)是載體上攜帶一段細(xì)菌lacZ基因的α肽編碼序列，其編碼產(chǎn)物為β-半乳糖苷酶的α肽。當(dāng)無(wú)外源DNA插入時(shí)，質(zhì)粒表達(dá)α肽。突變型Lac-E.Coli可表達(dá)該酶的ω肽。單獨(dú)存在的α及ω肽均無(wú)β-半乳糖苷酶活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時(shí)共表達(dá)這兩個(gè)肽時(shí)，宿主細(xì)胞內(nèi)才有β-半乳糖苷酶活性，在含有底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D-半乳糖苷）的誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基硫代- β-D-半乳糖苷）條件下，菌落呈藍(lán)色，這就是α-互補(bǔ)。如果LacZ基因由于插入外源基因而失活，結(jié)果無(wú)α肽表達(dá)，轉(zhuǎn)化菌落無(wú)α-互補(bǔ)，缺乏β-半乳糖苷酶活性，在含有X-gal培養(yǎng)板上為白色菌落，而載體自身環(huán)化后轉(zhuǎn)化的細(xì)菌為藍(lán)色菌落。由于這種顏色標(biāo)志，重組子與非重組子的區(qū)別一目了然，可以很容易將之區(qū)分。
（二）限制酶圖譜篩選（電泳篩選）
（三）核酸雜交篩選
（四）免疫化學(xué)篩選
四.操作步驟
1.將大腸桿菌DH5α 在LB平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)16-20hr
2.從平板上挑取一個(gè)2-3mm大小的單菌落移至2-5ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃強(qiáng)烈振蕩過(guò)
3.取一三角瓶將菌液按1：100稀釋接種，37 ℃強(qiáng)烈振蕩培養(yǎng)3hr，此時(shí)細(xì)菌OD=0.2-0.4,為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)期前期
4. 將培養(yǎng)物置冰上10min后轉(zhuǎn)移置離心管中,4000rpm,4 ℃離心5min
5. 棄上清,加入10ml（50ml原培養(yǎng)物）冰浴冷的0.1M CaCl2溶液,致敏懸浮細(xì)胞,置于冰上10min
6. 4000rpm, 4℃離心5min回收細(xì)胞,棄上清,每50ml原培養(yǎng)物再加入2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液,懸浮細(xì)胞
7. 按每份200ul分裝細(xì)胞,若不24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,可在感受態(tài)細(xì)胞中加入終濃度為10%的滅菌甘油,置于-70 ℃冰箱保存
8. 加10ul含40ng的DNA溶液至200ul感受態(tài)細(xì)胞中,溫和混勻,置于冰上30min
9. 42 ℃熱沖擊90S,迅速放回冰上,將細(xì)胞冷卻1-2min,加入800ulLB培養(yǎng)基, 37 ℃,225rpm振蕩培養(yǎng)45-90min,讓細(xì)菌中的質(zhì)粒表達(dá)抗生素抗性蛋白
10. 取200ul轉(zhuǎn)化混合物鋪于LB+Amp（含有誘導(dǎo)物IPTG及生色底物X-gal）平板上,室溫放置至液體被瓊脂全部吸收,倒置平板于37℃培養(yǎng)12-16 小時(shí)