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士鋒生物RNA\siRNA\Oligo轉(zhuǎn)染注意事項
點擊次數(shù)：781 發(fā)布時間：2013-11-11
不同的實驗技術(shù)都是為了滿足不同的實驗需要，RNA轉(zhuǎn)染提供了另一種有別于DNA轉(zhuǎn)染的研究探索手段——直接將體外翻譯的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖體利用轉(zhuǎn)染技術(shù)帶入細(xì)胞中。由于不需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄即可直接翻譯，RNA轉(zhuǎn)染得到的結(jié)果比DNA轉(zhuǎn)染更快更直接，當(dāng)然于瞬時表達(dá)。RNA轉(zhuǎn)染的這些特性很適合某些研究：比如處于非分裂期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者很難用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，RNA病毒的研究，反義RNA的轉(zhuǎn)染，sirna轉(zhuǎn)染（RNA干擾）等等。
哪些因素影響rna轉(zhuǎn)染的效率?
既然都是核酸，傳統(tǒng)的DNA轉(zhuǎn)染方法都可以用來轉(zhuǎn)染RNA，不過zui頭疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。
RNA操作要注意的事項我們就不用羅嗦了，轉(zhuǎn)染中要額外注意的就是轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該是確認(rèn)無RNase污染的，而且也盡量避免和質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染混用——即使試劑本身兼容DNA和RNA轉(zhuǎn)染，你也要想到人家做質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染時往往不會這么小心，難免將污染混入，那你豈不是很冤?多數(shù)情況下轉(zhuǎn)染試劑都不建議自己分裝，因為不同的管材可能會影響轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性，那就更得不償失了。所以RNA的轉(zhuǎn)染試劑會更好一些。還有重要的一點就是要采用無RNAse污染的血清。
轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞匯合度常常會比DNA轉(zhuǎn)染高一點，也許是因為RNA轉(zhuǎn)染表達(dá)比DNA快?RNA轉(zhuǎn)染的用量必須參考轉(zhuǎn)染試劑說明，因為RNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例決定了轉(zhuǎn)染復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和凈電荷，以及是否容易被細(xì)胞膜吸附和內(nèi)吞。RNA少了固然表達(dá)不好，太多也會有毒性的問題。有的品牌轉(zhuǎn)染試劑有促核酸凝聚的試劑，幫助核酸折疊為較為致密的結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞沒有太大影響，轉(zhuǎn)染復(fù)合物和細(xì)胞共同孵育的時間越長當(dāng)然越好。不過，如果RNA本身帶有熒光標(biāo)記的化，檢測前通常要洗掉多余的RNA以免干擾結(jié)果。
除了操作，RNA本身的結(jié)構(gòu)也對轉(zhuǎn)染有一定的影響。哺乳動物的mRNA分子帶有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端PolyA尾巴，此外還有成為IRES（internal ribosomal entry site）的核糖體結(jié)合區(qū)，這些結(jié)構(gòu)或者有助于提高mRNA的穩(wěn)定性，或者有助于核糖體結(jié)合到mRNA上進行翻譯。對于體外轉(zhuǎn)錄得到RNA可以通過實驗加入模擬RNA5'端帽子結(jié)構(gòu)類似物而獲得這個保護性的“帽子”（Ambion公司有提供的），3'端PolyA尾巴也可以通過實驗添加。多數(shù)情況下添加這些元件有助于提高RNA進入細(xì)胞后的穩(wěn)定性。但是有時候IRES元件促進翻譯的進行，而到有的細(xì)胞株中，由于缺乏相應(yīng)的結(jié)合蛋白，IRES反而影響轉(zhuǎn)錄。這個在RNA轉(zhuǎn)染實驗設(shè)計中是要格外注意的。RNA干擾實驗中的sirna結(jié)構(gòu)對基因沉默效果也有影響，比如推薦添加的AA（N19）TT結(jié)構(gòu)（AA（N21）或者CA（N21）也是可以的）。這就不在轉(zhuǎn)染的討論范圍內(nèi)了。
Oligo轉(zhuǎn)染
反義寡核苷酸一度曾經(jīng)是制藥領(lǐng)域的希望之光。Oligo的轉(zhuǎn)染還是屬于DNA轉(zhuǎn)染，由于分子小，轉(zhuǎn)染的主要問題是轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定性。2'-O-methyl oligoribonucleotides比一般的Oligo穩(wěn)定，硫代S-Oligo可以抗拒核酸酶的降解但不可以磷酸化，如何選擇就要根據(jù)實驗?zāi)康亩恕?/p>
我們終于結(jié)束了轉(zhuǎn)染這一部分。希望對你有所幫助。zui后我們再順帶介紹通常在轉(zhuǎn)染時遇到問題該如何面對——畢竟不同的細(xì)胞和不同的實驗?zāi)康?，遇到困難往往是難于預(yù)料的，所以無論前人是否已經(jīng)為你提供了現(xiàn)成的方法，如果是除初次嘗試某種試劑或者某種細(xì)胞系，這幾個對照是一定要做的：空白對照，只加一定量核酸的對照，只加一定量轉(zhuǎn)染試劑的對照，2個以上不同的量比實驗，對于檢查問題是非常有用的。
轉(zhuǎn)染效率低：可能的原因：
轉(zhuǎn)染試劑不適合（比如空白對照的細(xì)胞存活率就低等等）
轉(zhuǎn)染試劑和核酸或者蛋白的量不夠，或者比例不對（自行調(diào)整咯，別告訴我你不會）
基因表達(dá)時間（檢測時間）有問題（孵育更長時間吧，如果沒有毒性問題的化，如果毒性也隨轉(zhuǎn)染效率提高，那就要縮小孵育時間拉）
副作用（比如目的基因的毒性）（換誘導(dǎo)型啟動子吧）
核酸或者蛋白質(zhì)量問題（重做純化實驗）
報告基因或者檢測系統(tǒng)的問題
細(xì)胞死亡率高：
過量的轉(zhuǎn)染試劑或者轉(zhuǎn)染復(fù)合物（減少用量或者減少孵育時間，轉(zhuǎn)染后洗細(xì)胞）
細(xì)胞問題（重新復(fù)蘇活化一個細(xì)胞株，或者重新傳代）
目的基因毒性（減少用量）
轉(zhuǎn)染效率重復(fù)性差：
細(xì)胞匯合度不同（保證同樣的接種量同樣的時間）
支原體污染（殺了它吧，重新復(fù)蘇一管新的）
細(xì)胞傳代次數(shù)太高了（重新復(fù)蘇一管新的細(xì)胞）
血清質(zhì)量不穩(wěn)定（一次囤積同一批號的血清吧）