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士鋒生物堿裂解法大量提取質(zhì)粒
點(diǎn)擊次數(shù)：735 發(fā)布時(shí)間：2013-11-13
堿裂解法大量提取質(zhì)粒（500mL菌液）
1、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期（一般培養(yǎng)12～16小時(shí)）的含待提質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液于離心杯中，配平，4℃下4000rpm離心15min，棄上清，然后將離心管倒置于干凈的約紙上使上清液全部流盡。
2、向盛有細(xì)菌沉淀物的離心管中加入20mL冰冷的溶液Ⅰ，重懸沉淀（先加5mL溶液Ⅰ，用干凈的玻璃棒攪拌均勻后，再加剩下的部分）。
3、加入40mL冰冷的新配制的溶液Ⅱ，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心數(shù)次，使離心管內(nèi)溶物充分混勻。此步需注意：混勻過(guò)程不可用力過(guò)猛，否則容易導(dǎo)致基因組DNA污染。正確的方法是：緩緩地顛倒離心管數(shù)次或雙手持管使其軸線水平，并使管沿軸線旋轉(zhuǎn)，直到內(nèi)容物粘稠有“拉絲”為止。
4、加30mL用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊瓶蓋，搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，冰上放置15 min，此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。
5、配平，4℃下4400rpm離心15min。注意：如果第4步混合不均勻，則不能形成致密的沉淀，下步取上清液則應(yīng)用紗布過(guò)濾。
6、用紗布過(guò)濾取上清液，加入0.6倍體積異丙醇，-20℃靜止20min使質(zhì)粒沉淀。
7、配平，4℃下8500rpm離心10min，棄上清，倒置于吸水紙上。沉淀用數(shù)mL70%乙醇洗，干燥后，用10mL的TE溶解質(zhì)粒沉淀。
8、加等體積冰預(yù)冷5mol/L的LiCl溶液，混勻后，4℃下放置10min。此步的目的是使大片段的RNA和大分子的蛋白質(zhì)沉淀。
9、配平，4℃下8500rpm離心10min，保留上清，加2倍的無(wú)水乙醇，-20℃靜置20min使質(zhì)粒沉淀。
10、同7步，并將質(zhì)粒溶液中加入20μL的rnaseA（終濃度20μg/mL），37℃放置0.5-1h。
11、分別加入等體積萃取液（酚：氯仿：異戊醇=25：24：1），振蕩混勻，配平，4℃下8500rpm離心10 min。
12、取上層水相至新的EP管中，加入等體積氯仿/異戊醇（24：1），振蕩混勻，配平，4℃下8500rpm離心10 min。
13、取上層水相于新的EP管中。注意：13和14步對(duì)提高提取的質(zhì)量和產(chǎn)率比較重要。
14、加入等體積的PEG-NaCl溶液，輕輕混勻，室溫靜置30min（大于10min）。
15、配平，4℃下8500rpm離心10min，沉淀用數(shù)mL70%乙醇洗。
16、待乙醇揮發(fā)干凈后，將沉淀溶于1-5mLTE或DDW（雙蒸水）中。
溶液配制
一、溶液Ⅰ配制
溶液Ⅰ組成：葡萄糖，EDTA，Tris-HCl。三種物質(zhì)在溶液Ⅰ中的終濃度分別為：0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/L Tris-HCl、pH8.0，0.01mol/L EDTA、pH8.0。
配制方法：按上述各物質(zhì)終濃度，把各自均配制成十倍濃度的溶液，配制溶液Ⅰ時(shí)，取三種十倍溶液各1體積于一容器中，定容至10體積即得溶液Ⅰ。
配制體積 500mL 1000mL
（1）葡萄糖（M=198.17）： 0.05 mol/L 4.954g 9.909g
10倍： 0.5 mol/L 49.54g 99.09g
（2） Tris-HCl（M=121.1）: 0.025 mol/L 1.514g 3.028g
10倍： 0.25 mol/L 15.14g 30.28g
（3）EDTA（M=372.24）: 0.01 mol/L 1.861g 3.722g
10倍： 0.1 mol/L 18.61g 37.22g
注：溶液Ⅰ一次可配制100mL或更多，在15psi（1.05kg/cm2）壓力下蒸汽高壓滅菌15～30min，保存于4℃環(huán)境中備用。
二、溶液Ⅱ配制（現(xiàn)用現(xiàn)配，不用高壓滅菌）
溶液Ⅱ組成：NaOH,SDS。兩種物質(zhì)在溶液Ⅱ中的終濃度分別為：0.2mol/L NaOH，1%SDS（m/V）。根據(jù)需要體積（V），各自配制成2倍濃度1/2體積（V/2），兩者等體積混合即得。
配制體積 250mL 500mL
（1）NaOH（M=40.01）： 0.2 mol/L 2.00g 4.00g
2倍： 0.4 mol/L 4.00g 8.00g
（2）SDS（M=121.1）: 1% 2.5g 5g
2倍： 2% 5g 10g
三、溶液Ⅲ配制（用乙酸調(diào)Ph4.8）
溶液Ⅲ組成：乙酸鉀，冰乙酸。兩種物質(zhì)在溶液Ⅲ中的終濃度分別為：5mol/L乙酸鉀，冰乙酸（由溶液Ⅲ體積決定），即配制100體積溶液Ⅲ：60體積5mol/L乙酸鉀，11.5體積冰乙酸，28.5體積滅菌水。
例如：預(yù)配制100mL溶液Ⅲ：
5mol/L乙酸鉀： 60.0mL
冰乙酸： 11.5mL
滅菌水： 28.5mL
配制體積 500mL 1000mL
（1）乙酸鉀（M=98.14）： 5mol/L 245.35g 490.7g
注：溶液Ⅲ不需要高壓滅菌，但5mol/L乙酸鉀溶液需要高壓滅菌!
三、TE溶液配制（需要高壓滅菌）
TE溶液組成：Tris-HCl，EDTA。兩種物質(zhì)在TE溶液中的終濃度分別為：0.01mol/L Tris-HCl、pH8.0,0.001mol/L EDTA、pH8.0。
配制體積 500mL 1000mL
（1） Tris-HCl（M=121.1）: 0.01 mol/L 0.6055g 1.211g
10倍： 0.1 mol/L 6.055g 12.11g
（2） EDTA（M=372.24）: 0.001 mol/L 0.1861g 0.3722g
10倍： 0.01 mol/L 1.861g 3.722g
注：TE溶液使用量比較大時(shí)，可配制成十倍的TE溶液，用時(shí)再稀釋。
五、5mol/L氯化鋰溶液配制（需要高壓滅菌）
配制體積 500mL 1000mL
（1）無(wú)水氯化鋰（M=42.39）： 5mol/L 105.98g 211.95g
（2）一水氯化鋰（M=60.41）： 5mol/L 151.025g 302.05g
六、PEG-NaCl溶液配制（不用高壓滅菌）
PEG-NaCl溶液組成：PEG8000，NaCl。兩種物質(zhì)在TE溶液中的終濃度分別為：13%PEG（m/V）,1.6 mol/L NaCl。（注：m/V即質(zhì)量/體積）
配制體積 500mL 1000mL
（1）PEG（M=）： 13% 65g 130g
（2）NaCl（M=58.44）： 1.6 mol/L 46.75g 93.50g
七、LB液體培養(yǎng)基配制（高壓滅菌）
配制一升LB液體培養(yǎng)基配方： 一倍配方 十倍配方
（胰）蛋白胨： 10g 100g
酵母提取物： 5g 50g
氯化鈉： 5g 50g
注：液體培養(yǎng)基用量較大時(shí)，可配制成10倍的培養(yǎng)基，用時(shí)稀釋即可。
八、LB固體培養(yǎng)基配制（高壓滅菌）
配制一升LB固體培養(yǎng)基配方：
（胰）蛋白胨： 10g
酵母提取物： 5g
氯化鈉： 5g
瓊脂粉： 15g
九、核糖核酸酶A溶液配制
制備不含DNA酶的RnaseA：將胰核糖核酸酶（RnaseA）溶解在0.01mol/L的醋酸鈉緩沖液（pH5.2）中，使終濃度為10mg/mL，沸水煮15min，放在室溫下，緩慢冷卻，用0.1體積的1M Tris-HCl（pH8.0）調(diào)整pH至7.4左右，分裝小管保存在-20℃?zhèn)溆谩?/u>
注：當(dāng)濃縮的溶液在中性pH條件下加熱到100℃時(shí)，核糖核酸酶（RnaseA）會(huì)產(chǎn)生沉淀。