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士鋒生物免疫磁珠方法分選細胞
點擊次數：742 發(fā)布時間：2013-12-23
用免疫磁珠做細胞分選(MACS)是簡捷的免疫細胞及其它細胞的分離純化方法。
原理是已包被一抗的磁珠與細胞表面相應分子特異性結合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預先已與細胞表面分子特異結合的一抗結合。磁珠攜帶與之結合的細胞吸附于分離柱/試管上，實現(xiàn)陽性細胞分離或陰性細胞的分離。本節(jié)介紹超微磁珠間接標記、用分離柱陽性分選細胞的方法。
Protocal：
1.離心收集待分離細胞，用少量PBE孵育液(0.5％BSA、0.08％EDTA PH7.2 PBS，真空抽濾除菌及液體內氣體)充分混懸細胞(0.5ml/1×108細胞)，加入一抗(10~20μg/ml終濃度)，4° C孵育30分鐘。
2.用20倍體積PBE洗細胞一次，再加PBE(0.3ml/1×108細胞)充分混懸細胞后，加入相應二抗包被的超微磁珠，混勻后置8~15° C孵育10~15分鐘。
3.將分離柱安裝入磁場中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流盡，以預處理分離柱。
注：
1.如果分離細胞用作培養(yǎng)，全過程在超凈臺中完成。
2.超微磁珠及微小磁場系統(tǒng)適合于少量細胞分離(如106-107)，通常已適用于大多數實驗研究；此外各公司尚有大磁珠及大磁場供應，可用于更大量細胞的分選；除分離柱外，也有試管及其它設備用于分選；根據我們應用的經驗，分離柱由于提供了較大的接觸面，在細胞分選上具有較多優(yōu)點。磁場也可以自制，用一般的磁鐵即可做成簡易磁場，可提供足夠的磁力。
3.磁珠分離系統(tǒng)分離的細胞純度可以達到80~99％，得率在60~90％左右，僅次或相當于流式細胞儀（FACS）的分選效率，與FACS 相比，MACS設備簡單，耗時極短，故而應用廣泛。MACS也可用做FACS分選前的預分離，以減少FACS所用時間。另外連續(xù)兩次過柱分選可進一步提高分選細胞純度，通常可達95－99％。
4.在分離柱尾接上限速針頭，收集的流下的細胞即為陰性選擇細胞，一般純度低于陽性選擇。
5.分離柱一般只能一次應用，再用時降低分離效率；
6.分選下的細胞可用熒光標記抗體(一抗或二抗)標記后FACS鑒定純度；我們用熒光抗體直接標記細胞后，用二抗包被磁珠分選出細胞，直接做FACS分析，也可實現(xiàn)分選和純度檢測。
7.陽性選擇后，如需用第二種表面標志繼續(xù)分離，可以用剪切酶剪切下之結合的磁珠和一抗，再次進行下一輪分選。如需進行細胞功能分析，也可經培養(yǎng)12~24小時，使結合的磁珠脫落后進一步使用陽選的細胞做研究。
分選的效率在很大程度上取決于實驗者對關鍵環(huán)節(jié)的把握。我們建議實驗者在操作前認真閱讀相應的說明書及以下特別值得提出引起重視的有以下幾點：
1.待分選細胞中如有貼壁細胞，建議在分選前先貼壁培養(yǎng)去除，或者提高EDTA濃度；
2.抗體包被磁珠對死細胞常有非特異性結合。因而分選前去除死細胞；
3.新鮮分離骨髓細胞，先用膠原酶、DNA酶、胰酶聯(lián)合消化，可使細胞團塊解聚，從而提高分離效率。
4.上分離柱前，充分振蕩，混懸細胞，打散細胞團塊；
5.用分離柱分選，應用真空抽濾水，減少水中氣泡，使分離柱不被氣泡阻滯；
6.細胞懸液加入分離柱中時，應將滴管伸至底壁后加入，避免將細懸液沿管壁流入，使管壁殘流末分選細胞，以致后繼洗柱過程中，因疏忽末被洗下，zui后導致純度不高。洗柱時，應在前次液體充分流盡后，再加洗液。
7.分選細胞量應根據說明書控制，不超量；
8.孵育時間和溫度應按說明書進行，延長孵育時間、提高溫度會增加非特異結合；
9.先用抗體阻斷Fc受體，可降低非特異性結合；