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PCR反應(yīng)所需細(xì)菌DNA 模板的制備
點(diǎn)擊次數(shù)：606 發(fā)布時(shí)間：2014-2-9
從分析的標(biāo)本中純化核酸，即制備pcr反應(yīng)的模板，是使PCR獲得成功的重要的*步。由于PCR的用途各異，用于抽提核酸的起始材料種類可能差異很大(包括新鮮的、儲(chǔ)存的和古代的)。每種特殊樣品類型有各自的限制和抽提核酸的不同要求，但它們都有一個(gè)共同的標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增的靈敏性要求特別注意不同材料、PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒或?qū)φ罩g可能存在的交叉污染。由于PCR不需要高分子量和高度純化的核酸，為zui大限度材料污染的機(jī)會(huì)，可以使用快速而且簡(jiǎn)便的提取方法。
【試劑與配制】
TE緩沖液(pH8.0)
裂解緩沖液：2%SDS，10μg/ml蛋白酶k溶于TE中。
rnase A (10mg/ml)
平衡酚
氯仿：異戊醇(24：1)
無(wú)水乙醇
70% 乙醇
3mol/L 乙酸鈉(pH5.2)
【操作方法】
1、方法一
(1)從平板上挑取至少1.5mm的菌落到一微量離心管中，加入400μl裂解緩沖液，混勻;
(2)55℃～60℃，水浴15～20min;
(3)加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，混勻;
(4)5000g離心10min;
(5)吸取上層水相，再加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1);
(6)重復(fù)(3)～(4);
(7)吸取上層水相，加1/10體積3mol乙酸鈉及RNase A(終濃度為0.25～0.3μg/μl)，輕搖，37℃保溫30 min;
(8)加入2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20℃ 2hr;
(9)10,000g 離心15min，棄上清，或用無(wú)菌細(xì)玻棒攪?yán)p出DNA;
(10)70% 乙醇洗2次，待乙醇蒸干后重新溶于小體積去離子水或TE緩沖液中(約20μl)。一次取5～10μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。
2、方法二
(1) 取一定數(shù)量的細(xì)菌加入500μlTE緩沖液中;
(2) 100℃煮沸10min，置冰浴保存;
(3) 10,000rpm，4℃離心10min;
(4) 取適量上清作為PCR 模板。
3、方法三
(1) 制備一定濃度的細(xì)菌/去離子水懸液，反復(fù)凍融3次;
(2) 10,000rpm，4℃離心10min;
(3) 取適量上清作為PCR 模板。