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士鋒生物基因芯片實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞和組織制備規(guī)程
點(diǎn)擊次數(shù)：703 發(fā)布時間：2014-2-12
細(xì)胞標(biāo)本采集操作建議規(guī)程
1. 所有樣品均應(yīng)有樣品標(biāo)簽(注明樣品編號)，同時有一張樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等。
2. 一張芯片實(shí)驗(yàn)一般要求細(xì)胞數(shù)在1E+08，建議設(shè)計實(shí)驗(yàn)和收獲細(xì)胞時可考慮多收集一些。
3. 貼壁與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，保留的細(xì)胞用PBS緩沖液洗一下，除去緩沖液，加溶液D*充分溶解細(xì)胞，放入液氮運(yùn)輸。樣品量以實(shí)際得到的total RNA為準(zhǔn)。
4. 血液：將白細(xì)胞分離出來，加溶液D充分溶解細(xì)胞，放入液氮運(yùn)輸。樣品量以實(shí)際得到的total RNA為準(zhǔn)。
5. 如果是細(xì)胞未經(jīng)溶液D處理，直接凍入液氮罐(不推薦)。工作人員會對細(xì)胞作相關(guān)處理，以便為細(xì)胞記數(shù)。
6. 以上提到的均是新鮮細(xì)胞，對一些已老化或質(zhì)量不明的細(xì)胞，工作人員有權(quán)提出疑義，并要求退回或重新取樣。
不同組織抽提3-10μg mrna所需組織量
| 器官/組織* | 提取3μgmRNA所需組織量(克) | 提取10μgmRNA所需織量(克) | 總RNA得率[單位:毫克RNA/克組織] | mRNA所占百分比[%] | |
| 成人正常組織 | 肝 | 0.2083 | 0.6944 | 1.80 - 1.80 mg/g | 0.80 |
| 成人正常組織 | 腦 | 缺數(shù)據(jù) | 缺數(shù)據(jù) | 1.30 - 1.30 mg/g | 缺數(shù)據(jù) |
| 成人正常組織 | 肺 | 0.3000 | 1.0000 | 1.00 - 1.00 mg/g | 1.00 |
| 成人正常組織 | 心 | 0.5000 | 1.6667 | 0.60 - 0.60 mg/g | 1.00 |
| 成人正常組織 | 胃 | 0.1852 | 0.6173 | 2.70 - 2.70 mg/g | 0.60 |
| 成人正常組織 | 喉 | 0.3125 | 1.0417 | 1.20 - 1.20 mg/g | 0.80 |
| 病理組織 | 結(jié)腸癌 | 0.2521 | 0.8403 | 1.70 - 1.70 mg/g | 0.70 |
| 病理組織 | 胃癌 | 0.4317 | 1.4388 | 0.50 - 0.50 mg/g | 1.39 |
| 病理組織 | 空腸腺癌 | 0.3571 | 1.1905 | 1.40 - 1.40 mg/g | 0.60 |
| 病理組織 | 直腸癌 | 0.1604 | 0.5348 | 1.70 - 1.70 mg/g | 1.10 |
| 病理組織 | 肝癌 | 0.1116 | 0.3720 | 3.84 - 3.84 mg/g | 0.70 |
| 病理組織 | 肺癌 | 0.1282 | 0.4274 | 2.00 - 2.00 mg/g | 1.17 |
考慮到個體差異以及樣品在研磨、勻漿等過程中的損失，客戶提供的樣品量應(yīng)在上述基礎(chǔ)上增加1-2倍。
組織標(biāo)本采集操作建議規(guī)程
| 鋁箔 | 經(jīng)DEPC水浸泡，78°C烘干，高壓滅菌后烘干 |
| 1.5 ml 微離心管 15 ml 聚丙烯離心管 | 市場有售RNAase-Free的相應(yīng)規(guī)格離心管 |
| 標(biāo)簽紙 | |
| 記號筆 | |
| 樣品登記表 | 由客戶專人填寫 |
| 液氮罐 | 應(yīng)常備液氮罐，并保證液氮的來源 |
| 取材部位的病理切片 | 由客戶提供1-2張 |
注：
· 以下步驟1 - 5應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過15分鐘，超過時間會導(dǎo)致樣品的RNA降解。
· 對腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對于手術(shù)切除的整個或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報告的結(jié)果來判定要進(jìn)行研究的取材部位。
1. 離體新鮮組織，切成多個1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜;肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈(正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈)。
2. 在RNase-Free 0.9%生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。
3. 用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。
4. 填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等 。
5. 將液氮冷卻的組織放入樣品袋(每個樣品袋只保存同樣的組織)，袋口留一根編號繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙(標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號、日期)，迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐。
6. 保留1-2張取材部位的病理切片。
基因芯片樣品的制備要點(diǎn)：
1.目的DNA的選擇對于大規(guī)模地研究基因表達(dá)問題，需要分析每一個基因的表達(dá)。因此，選擇的目的DNA必須能夠代表要研究的各個基因。對于整個基因組序列全部已知的生物，zui直接的方法是用PCR擴(kuò)增基因組中每個已知的或預(yù)測的開放閱讀框架(openreadingframe)，亦可以選擇自己感興趣的部分序列。對于沒有測序，或只有部分測序的基因組，或者對于那些有大量內(nèi)含子的基因組，上述方法就不現(xiàn)實(shí)。在這種情況下，我們首先考慮采用表達(dá)序列標(biāo)記(EsT)?？梢詫蝹€EST的cD一NA克隆用作陣列DNA來源。對于還沒有基因組測序計劃或序列還未知的生物，可以利用cDNA文庫作為DNA來源。當(dāng)然這種文庫是經(jīng)歸整化處理過，以減少不必要的冗余。
用作陣列的DNA可以是雙鏈的，亦可以是單鏈的。但是其長度是小于開放閱讀框架，或小于1000bp的cDNA。這對于很多具有同源性的基因尤為重要。當(dāng)基因之間具有很高同源性時，選擇基因之間有差異的部分，這樣便可以提高基因之間的分辨度。所以，在考慮每個基因代表性的同時，應(yīng)充分考慮所研究問題的具體情況。
2.pcR擴(kuò)增一般而言，100uLIPCR反應(yīng)體系得到的產(chǎn)物足以點(diǎn)印：000個基因芯片。PcR通常是在96孔PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)際擴(kuò)增的反應(yīng)條件要根據(jù)所用的模板及引物來確定。但要盡量減少PCR反應(yīng)體系中的組分，盡量只用模板、引物、核昔酸、Mg標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和酶。不要用甘油或明膠，它們往往會粘附在陣列塊上而影響以后的點(diǎn)樣工作。
3.點(diǎn)樣前DNA準(zhǔn)備點(diǎn)樣以前，要將pcR產(chǎn)物清洗純化干凈，并且對DNA進(jìn)行一些處理，一般用異丙醇沉淀PCR產(chǎn)物，以除去酶、離子及核昔酸等。沉淀后用70%乙醇院1次，再用95%乙醇洗1次，待*干燥后，將所沉淀DNA重溶在3xSSC中，其濃度掌握在100ny…左右、由于處理的樣本量很大，一般直接在96孔板上直接操作，可選用能夠配置96孔板的離心機(jī)(如SavantSpeedVacPlussC210A)。當(dāng)把DNA溶于10～15tL13XSSC(pH7.0)中后，置于4”C至少12h。然后，將DNA溶液封存在一20C～4”C。
除極個別特殊的樣品外，大多數(shù)的生物樣品不能與基因芯片反應(yīng)。對此，應(yīng)該對樣品進(jìn)行提取擴(kuò)增獲取其中的目的蛋白質(zhì)或基因，然后標(biāo)記，可提高檢測的靈敏度和實(shí)驗(yàn)操作人員的安全性。