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士鋒生物細(xì)胞周期測(cè)定的方法步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：558 發(fā)布時(shí)間：2014-2-21
<img alt="細(xì)胞周期測(cè)定的方法步驟" 細(xì)胞周期測(cè)定的方法步驟"="" border="1" height="355" data-cke-saved-src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120928/0923303359-0.jpg" src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120928/0923303359-0.jpg" width="355" style="vertical-align: middle; border: 0px; width: 285px; height: 274px;">
一、原理
細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。
單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。
測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測(cè)定細(xì)胞周期的方法。
BrdU (5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
2、試劑：BrdU(1.0mg/ml)，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
三、操作步驟
1、細(xì)胞生長至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使zui終濃度為10μg/ml。
2、44小時(shí)加秋水仙素，使每毫升中含0.1μg。
3、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。
4、常規(guī)染色體制片。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
8、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)*、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。
9、計(jì)算：
細(xì)胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3 +4M4)/100}(小時(shí))
附：(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。