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士鋒生物單向定量免疫電泳
點(diǎn)擊次數(shù)：609 發(fā)布時(shí)間：2014-5-4
單向定量免疫電泳又稱火箭電泳（rocket immunoelectrophoresis）。在瓊脂內(nèi)摻入適量的抗體，在電場作用下，定量的抗原泳動(dòng)遇到瓊脂內(nèi)的抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物沉淀下來。走在后面的抗原繼續(xù)在電場作用下向正極泳動(dòng)，遇到瓊脂內(nèi)沉淀的抗原—抗體復(fù)合物，抗原量的增加造成抗原過量，使復(fù)合物沉淀溶解，一同向正極移動(dòng)而進(jìn)入新的瓊脂內(nèi)與未結(jié)合的抗體結(jié)合，又形成新的抗原—抗體復(fù)合物沉淀下來，不斷地沉淀—溶解—再沉淀，直至全部抗原和抗體結(jié)合，在瓊脂內(nèi)形成錐形的沉淀峰，稱火箭電泳?；鸺宓拈L度與標(biāo)準(zhǔn)抗原比較，可計(jì)算待測抗原的濃度。
本實(shí)驗(yàn)以人血清作為抗原，免疫動(dòng)物（家兔）產(chǎn)生抗血清，當(dāng)適量抗原、抗體在瓊脂糖中擴(kuò)散，兩者相遇時(shí)，則形成抗原抗體復(fù)合物的白色沉淀線。不同的抗原分子與相應(yīng)的抗體分子的擴(kuò)散速度不同，當(dāng)兩者間比例適當(dāng)時(shí)，出現(xiàn)數(shù)目不同的沉淀線，根據(jù)沉淀線的出現(xiàn)可以定性抗原、診斷疾病或測定抗體的效價(jià)。
試劑和器材
一、試劑
抗原：胎甲球蛋白（1—5mg/mL）。
免疫血清（抗血清）：家兔抗人胎甲球蛋白血清。
瓊脂糖（或進(jìn)口分裝瓊脂粉）。
pH 8.6電極緩沖液（巴比妥緩沖液）離子強(qiáng)度0.05m：取巴比妥1.84g, 巴比妥鈉10.3g溶于蒸餾水，定溶至1L。制備瓊脂溶液時(shí)需要將上述緩沖稀釋一倍，離子強(qiáng)度為0.025m。
二、器材
載玻片、打孔器、微量取液器、稀釋板、培養(yǎng)器或帶蓋培養(yǎng)皿。
操作方法
一、抗體瓊脂板的制備
將融化的瓊脂冷卻到55℃，加入適量（看免疫血清的效價(jià)高低而定）的抗體，立即混勻（不要出現(xiàn)泡沫），將上述的抗體瓊脂（大約20ml）制成瓊脂板，冷卻后按圖4.10打孔備用。
單向定量免疫電泳（火箭免疫電泳）二、加樣在各孔里加入不同稀釋度的抗原。
三、電泳
在平板電泳槽里倒進(jìn)離子強(qiáng)度m=0.05的巴比
妥緩沖液。將凝膠板平放在電泳槽中的隔板上。
瓊脂的兩端用浸溫的濾紙做橋與電泳槽的電極緩
沖液相連接，抗體端接正極。通電，電流強(qiáng)度按
瓊脂板的寬度計(jì)算（1-2mA/cm）。觀察到白色沉
淀線時(shí)，即電泳完畢（一般1小時(shí)左右）。一般
通電后調(diào)電壓為10V/cm ，或電流強(qiáng)度為2~4m
A/cm時(shí)間約1~5小時(shí)。
四、定量抗原
在電泳一定時(shí)間后可以觀察到火箭狀的白色沉淀峰。電泳完畢后可以用肉眼觀察量出已知抗原量的各個(gè)火箭的高度，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可測出未知濃度的抗原量。如果計(jì)算的話，可用求積儀測定峰的面積。
注意事項(xiàng)
（1）影響單向定量免電泳的因素很多，主要是要選擇好抗體濃度，使抗原抗體濃度比例合適。這就需要根據(jù)免疫血清的效價(jià)來定所加入瓊脂中的抗體量，如效價(jià)高，則免疫血清瓊脂的比例為1：5-9，如效價(jià)低，則免疫血清與瓊脂的比例為2：5。
（2）加入的抗體量要合適，以保證抗原、抗體的合適比例，以便形成清晰的沉淀峰。抗體的準(zhǔn)確用量應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來決定，即：加入不同量的抗血清，用一定量的抗原進(jìn)行火箭電泳，選出沉淀峰在2-5cm之間的相應(yīng)抗體濃度就是合適的抗體用量。