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士鋒生物聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物同工酶
點(diǎn)擊次數(shù)：613 發(fā)布時(shí)間：2014-5-29
同工酶是指能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。研究表明，植物在發(fā)育過程中，所含同工酶的種類和比例都不相同，它們與植物的遺傳、生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定關(guān)系，因此作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，測定同工酶譜是認(rèn)識基因存在和表達(dá)的一種工具，在植物的種群、發(fā)育及雜交遺傳的研究中有重要的意義。
過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化，測定這種酶的活性或其同工酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。
利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定同工酶，方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)，測定結(jié)果便于觀察、記錄和保存。本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，分離小麥幼苗過氧化物酶同工酶，根據(jù)酶的生物化學(xué)反應(yīng)，通過染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶，以鑒定小麥幼苗過氧化物酶同工酶。
通過本實(shí)驗(yàn)要掌握電泳技術(shù)的原理、方法、裝置、凝膠配制等知識，熟悉主要的操作過程，同時(shí)對同工酶有一個(gè)感性的認(rèn)識。
二、原理
1．電泳
帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。近幾十年來，電泳作為一項(xiàng)有效的分析、分離和制備技術(shù)發(fā)展很快，在生產(chǎn)、科研和醫(yī)療工作中得到了廣泛應(yīng)用。用電泳技術(shù)分離、分析蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子，有較高的分辨率，目前已成為生物科學(xué)研究中*的手段之一。
2．影響電泳的主要因素
若將帶凈電荷q 的粒子放入電場，則該粒子所受到的引力F 引可用數(shù)學(xué)式表示如下：
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物同工酶 ⑴
式中E 為電場強(qiáng)度，單位為“v/cm”，表示電場中單位距離上的電位差。
如果這種情況發(fā)生在真空中，則帶電粒子會朝著電極加速前進(jìn)并且zui后與電極相撞。但在溶液中，由于電場的牽引力F 引與加速運(yùn)動的粒子和溶液之間產(chǎn)生的阻力（即摩擦力）F 阻相對抗。故上述現(xiàn)象不會發(fā)生。根據(jù)Stokes 公式，阻力的大小取決于粒子的大小和形狀以及所在介質(zhì)的粘度：
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物同工酶 ⑵
式中F 阻 是球形粒子所受的阻力，r 是球形粒子的半徑，η是溶液的粘度，v 是粒子移動的速度。在溶液中，由電場而產(chǎn)生的加速力被阻力所對抗，因此，
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物同工酶 ⑶
將（3）式整理得：
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物同工酶 ⑷
由此可以看出，粒子移動的速度（v）與電場強(qiáng)度（E）和粒子所帶電荷量（q）成正比，而與粒子的大?。╮）和溶液的粘度（η）成反比。非球形粒子（如DNA）在電泳過程中會受到更大的阻力，即粒子的移動速度還與粒子形狀有關(guān)。
既然在一定pH 條件下，每一分子都具有特殊的電荷（種類與數(shù)量）、大小和形狀，在一定的時(shí)間內(nèi)它在相同的電場中便應(yīng)集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析、鑒定的基本原理。
由于帶電粒子的泳動速度受電場強(qiáng)度影響，使得同一帶電粒子在不同電場里泳動速度不同。為了便于比較，常用遷移率（或稱泳動度）代替泳動速度表示粒子的泳動情況。遷移率（泳動度）的定義為“帶電粒子在單位電場強(qiáng)度下的泳動速度”，若以m 表示遷移率，則
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物同工酶 ⑸
將（4）式代入（5）式，得
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物同工酶 ⑹
由（6）式可以看出，遷移率（泳動度）僅與球形粒子所帶電荷的數(shù)量，粒子大小及溶液粘度有關(guān)，而與電場強(qiáng)度無關(guān)。由于氨基酸、蛋白質(zhì)、酶等的電離度a 隨溶液pH 變化而不同，所以實(shí)際上常使用有效遷移率。有效遷移率u 為遷移率m 和當(dāng)時(shí)條件下電離度a 的乘積。