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士鋒生物單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)影響因素的分析
點擊次數(shù)：492 發(fā)布時間：2014-6-16
單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)又稱“彗星”法，是一種操作簡便、快速、敏感性高的DNA 損傷與修復(fù)的檢測技術(shù)［1］。盡管此法無需復(fù)雜的實驗條件，但在建立過程中可能受諸多因素的影響而難以得到較理想的結(jié)果，我們就其主要的影響因素作如下分析。
1．瓊脂糖凝膠薄板的制備：該實驗需要制備兩層瓊脂糖凝膠薄板，應(yīng)注意瓊脂糖的濃度、制備時間和溫度。第1層是緊貼冰凍玻片砂面的1%正常凝點(42±2)℃的瓊脂糖凝膠，吸取85μl制成面積為18 mm×18 mm，厚度為0.25 mm的凝膠。然后置4℃存放約20分鐘，如時間過短，不能得到“老化”的凝膠與玻片粘合不緊,容易在液體浸泡處理和電泳過程中自然脫落，造成實驗失?。环粗?，如果放置時間過長，凝膠極易干裂而脫落。第2層凝膠是1%低凝點(26±2)℃瓊脂糖液，與細(xì)胞混合時瓊脂糖液的溫度30～37℃，溫度過高可引起細(xì)胞損傷，此操作過程力求快速，以免加速細(xì)胞DNA 的修復(fù)。
2．細(xì)胞數(shù)和實驗溫度的影響：
（1）實驗細(xì)胞數(shù)應(yīng)調(diào)至約3.0×105，如果細(xì)胞數(shù)過低，一張片子中細(xì)胞數(shù)太少，很難完成100個彗星計數(shù)分析；反之細(xì)胞數(shù)過高，片中細(xì)胞過密，位于不同層面的細(xì)胞相互重疊，難以分析彗星DNA損傷。
(2)實驗溫度的控制。樣品應(yīng)置4℃環(huán)境下進行，以抑制或降低核酸內(nèi)切酶等活性，阻止DNA損傷的修復(fù)，從而達(dá)到準(zhǔn)確地檢測DNA初級損傷。已有研究表明一些細(xì)胞DNA斷裂損傷能在1小時內(nèi)達(dá)到90%的修復(fù)，3小時達(dá)到97%［2］，因此，應(yīng)嚴(yán)格控制細(xì)胞在分析過程中的溫度。
3.堿化處理及電泳的條件:凝膠內(nèi)的細(xì)胞需在堿性(pH值10)環(huán)境下進行處理，其作用一是去除細(xì)胞蛋白質(zhì)，使DNA暴露出來；其次是堿化處理使DNA緊密螺旋結(jié)構(gòu)解旋，DNA損傷片斷及其極性端暴露出來［3］。
電泳條件：電壓或電流過大，嚴(yán)重受損傷的細(xì)胞可能出現(xiàn)的拖尾過長，彗星消失而影響結(jié)果，其次是正常的細(xì)胞可能因電壓或電流過大而形成少許拖尾的假陽性結(jié)果。反之，電壓或電流過小，受損傷的細(xì)胞不會出現(xiàn)拖尾，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。電泳的電壓多選用低電壓，一般在18～50 v，在電泳過程中電泳液的溫度應(yīng)不超過15℃(應(yīng)在4℃條件下進行)，電泳時間多在20～40分鐘。
4.熒光染色及彗星圖象分析：
(1) 采用DAPI熒光劑染色，質(zhì)量濃度在1～5 μg/ml，用量為10μl。染色15分鐘后即可觀察，視野中明亮熒光的“彗星”被光照時間一般不易超過2分鐘，以免熒光劑快速衰退而不宜繼續(xù)觀察和拍照。
(2) 彗星的圖像分析主要靠肉眼顯微鏡讀片，對DNA損傷程度標(biāo)準(zhǔn)的正確判斷是非常重要的。不同程度損傷可根據(jù)彗星的尾部與其頭部的比率大小分為0、1、2、3、4五個等級。0級無拖尾表明無損傷，當(dāng)DNA損傷程度由輕到重，則彗星的尾部逐漸變長變大，頭部逐漸變小熒光強度逐漸變?nèi)酢Ｓ萌庋塾^察判斷的分級需要通過計算機彗星圖象分析加以確定，目前已有彗星電腦分析軟件可供使用，如Komet3.0等［4］?？傊?，嚴(yán)格控制SCGE的各種影響因素，使其真正成為一種可靠、易于掌握和有效的DNA斷裂損傷和修復(fù)檢測的新技術(shù)［5］。
參考文獻
1 馬愛國, 韓秀霞,劉四朝,等. 兩種DNA斷裂損傷檢測方法敏感性比較. 遺傳, 1997，19: 32-34.
2 馬愛國, Collins AR, Duthie SJ, 等. 不同細(xì)胞DNA氧化損傷及自身修復(fù)能力的分析. 癌變 畸變 突變，1997， 9:138-142.
3 Duthie SJ, Collins AR, Duthie GG, et al. Quercetin and myricetin protect against hydrogen peroxide-induced DNA damage (strand breaks and oxidised pyrimidines) in human lymphocytes. Mutat Res, 1997，393: 223-231.
4 Collins AR, Dobson VL, Dusinska M, et al. The comet assay: what can it really l us ? Mutat Res， 1997,375:183-193.
5 Collins AR, Dusinska M, Franklin M, et al. Comet Assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol mutagen, 1997, 30: 139-146.