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士鋒生物離子交換法分離氨基酸
點(diǎn)擊次數(shù)：635 發(fā)布時(shí)間：2014-7-3
離子交換層析(ion exchange chromatography，簡稱ICE)是分析和制備樣品混合物的液-固相層析方法，是基于待測物質(zhì)的陽離子或陰離子和相對(duì)應(yīng)的離子交換劑間的靜電結(jié)合，即根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性等差異，通過離子間的吸附和脫吸附原理將電解質(zhì)溶液各組分分開。它是從復(fù)雜混合物體系中分離性質(zhì)極為相似的生物分子的有效手段之一。由于帶電荷不同的各種物質(zhì)對(duì)離子交換劑有不同親和力，通過改變洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值，控制這種親和力，即可使這些物質(zhì)依據(jù)親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來。
氨基酸是兩性電解質(zhì)，分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點(diǎn)和溶液的pH值，各種氨基酸分子結(jié)構(gòu)不同，在同一pH值時(shí)所帶電荷的性質(zhì)(正、負(fù))和多少不同，與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可根據(jù)親和力從小到大的順序被洗脫液分別洗脫下來，達(dá)到分離的效果。
三、儀器與試劑
(一)實(shí)驗(yàn)器材
(1)玻璃層析柱
(2)試管
(3)移液管
(4)恒壓洗脫瓶
(5)部分收集器
(6)水浴鍋
(7)分光光度計(jì)
(8)電爐
(二)材料與試劑
(1)苯乙烯磺酸鈉型樹脂(100~200目)
(2)2mol/L鹽酸溶液
(3)2mol/L氫氧化鈉溶液
(4)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：將天門冬氨酸和賴氨酸分別配成2mg/mL的0.1mol/L鹽酸溶液。
(5)混合氨基酸溶液：將上述天門冬氨酸和賴氨酸溶液按1：4比例混合。
(6)檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸溶液(pH5.8，鈉離子濃度0.45mol/L)：取檸檬酸14.25克、氫氧化鈉9.30克分別溶于水后混合，加入濃鹽酸5.25毫升，定容至500毫升;4℃冰箱保存。
(7)顯色劑：2克水合茚三酮溶于95%乙醇中，加水至100毫升。
四、操作步聚
(1)層析柱的準(zhǔn)備：將強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成Na+型后洗至中性，攪拌1小時(shí)后裝入層析柱，使之自然降沉到一定高度，用緩沖液平衡。
(2)平衡：用pH5.8的檸檬酸緩沖液沖洗平衡離子交換柱，調(diào)節(jié)流速，收集洗脫液至4倍床體積即可上樣。
(3)加樣分離：將液面緩慢放至貼近層析柱表面，由柱上端仔細(xì)加入氨基酸混合液0.25~0.5毫升，同時(shí)開始收集流出液。當(dāng)樣品液彎月面靠近樹脂頂端時(shí)，立即加入0.5毫升檸檬酸緩沖液。待緩沖液彎月面靠近樹脂頂端時(shí)，再加入0.5毫升檸檬酸緩沖液。如此重復(fù)兩次，然后用滴管小心注入檸檬酸緩沖液(切勿攪動(dòng)床面)。用試管收集洗脫液，每管收集1毫升，直至無氨基酸流出為止。
(4)氨基酸的鑒定：向各管收集液中加入1毫升水合茚三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中加熱15分鐘，冷至室溫測定光密度值。以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。(用以已知兩種氨基酸的純?nèi)芤簽闃悠罚瓷鲜龇椒ê蜅l件分別操作，將得到的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對(duì)照，即可確定兩個(gè)峰為何種氨基酸。)