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神經(jīng)細胞培養(yǎng)
點擊次數(shù)：1048 發(fā)布時間：2014-11-7
體外神經(jīng)細胞的培養(yǎng)已成為神經(jīng)生物學研究中十分有用的技術(shù)手段。神經(jīng)細胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點是:(1)分散培養(yǎng)的神經(jīng)細胞在體外生長成熟后,能保持結(jié)構(gòu)和功能上的某些特點, 而且長期培養(yǎng)能形成髓鞘和建立突觸,這就提供了體內(nèi)生長過程在體外重現(xiàn)的機會。(2)能在較長時間內(nèi)直接觀察活細胞的生長、分化、形態(tài)和功能變化,便于使用各種不同的技術(shù)方法如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、同位素標記、原位雜交、免疫組化和電生理等手段進行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化學和生物因子（如神經(jīng)營養(yǎng)因子）等實驗條件, 觀察條件變更對神經(jīng)細胞的直接或間接作用。(4)便于從細胞和分子水平探討某些神經(jīng)疾病的發(fā)病機制，藥物或各種因素對胚胎或新生動物神經(jīng)細胞在生長、發(fā)育和分化等各方面的影響。 我們實驗室從80年代始開展了神經(jīng)細胞的體外培養(yǎng)工作，取得了一些經(jīng)驗，現(xiàn)將培養(yǎng)細胞分類及方法簡要介紹如下:
一、雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織塊培養(yǎng)
主要用于神經(jīng)生長因子（NGF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物活性測定。在差倒置顯微鏡下觀察以神經(jīng)突起的生長長度和密度為指標半定量評估NGF的活性。
1、材料和方法
（1）選正常受精的雞蛋，置于37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，每日翻動雞蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的雞蛋, 用70% 酒精消毒蛋殼，從氣室端敲開蛋殼，用消毒鑷剝除氣室部蛋殼。
（3）用彎鑷鉤住雞胚頸部，無菌條件下取出雞胚置小平皿內(nèi)，除去頭部后，腹側(cè)向上置滅菌毛玻璃片上,用眼科彎鑷子打開胸腹腔，除去內(nèi)臟器官。
（4）在解剖顯微鏡下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其兩側(cè)，在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側(cè)排列的背根節(jié)（圖1），用一對5號微解剖鑷小心取出。
（5）置背根節(jié)于解剖溶液內(nèi)，用微解剖鑷去除附帶組織，接種于涂有鼠尾膠的玻璃或塑料培養(yǎng)瓶中，在DMEM無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
2、結(jié)果
雞胚背根神經(jīng)節(jié)在含神經(jīng)生長因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h,神經(jīng)節(jié)長出密集的神經(jīng)突起。而未加NGF的神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)24 h, 未見神經(jīng)突起生長。
二、新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經(jīng)節(jié)分散細胞培養(yǎng)
背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細胞起源于神經(jīng)嵴，NGF研究Levi-Montalcini的實驗表明，外原性NGF能刺激DRG細胞生長發(fā)育并形成廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在體外，分離培養(yǎng)的神經(jīng)節(jié)在NGF存在的情況下，神經(jīng)突起的生長在一天之內(nèi)可長達數(shù)毫米，因此，利用培養(yǎng)的DRG細胞，進行軸突生長發(fā)育的研究，是zui為經(jīng)典而常用的方法之一。
1、材料和方法
取新生一天的大鼠(wistar種)和小鼠(昆明種)。用眼科剪在無菌條件下除去背部皮膚, 然后剪取一段脊髓,背側(cè)朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側(cè)水平剪除腹側(cè)一半椎骨,暴露脊髓和神經(jīng)節(jié),用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)。雞胚背根神經(jīng)節(jié)的取材方法同前。 剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2×105 個細胞/ml密度的細胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml細胞懸液置。置標本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用飼養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神經(jīng)細胞的增殖, 作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。
2、培養(yǎng)液成份
種植培養(yǎng)液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L);10%胎牛血清; 10%馬血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。
飼養(yǎng)培養(yǎng)液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5 % 馬血清； NGF 20ng/ml；神經(jīng)營養(yǎng)素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。