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細(xì)胞破碎的方法
點(diǎn)擊次數(shù)：1271 發(fā)布時(shí)間：2014-11-17
一、細(xì)胞器的分離：制備某種生物大分子時(shí)，往往需要采用細(xì)胞中某一部分為材料；或者為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子，通常破碎細(xì)胞后，先分離各組分，以防干擾，這對制備—些高難度和高純度的生物大分子是必要的，細(xì)胞器的分離，一般采用差速離心法，此法是利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，在離心管不同區(qū)域沉降的原理，分離出所需組分，分離得到的細(xì)胞器，其純度可采用電子顯微鏡法、免疫學(xué)法或測定標(biāo)志酶活力法進(jìn)行鑒定。
二、細(xì)胞器的分離有時(shí)需要將組織細(xì)胞破碎，然后根據(jù)待分離的細(xì)胞器的理化特性，選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x方法。一般采用差速離心或密度梯度離心的方法達(dá)到分離細(xì)胞器的目的。
三、破碎方法：
(1)桿狀玻璃勻漿器法：該勻漿器由一根端部表面磨砂的玻璃桿和一個(gè)內(nèi)壁磨砂的玻璃套管組成。使用時(shí)，先用鋒利的刀片把組織塊切碎，然后把碎塊加入套管中，用力使玻桿移動(dòng)使組織細(xì)胞破碎。
(2)高速組織搗碎機(jī)法：使用時(shí)將4℃預(yù)冷的組織碎塊或細(xì)胞懸液加入搗碎機(jī)的梅花玻璃杯中，至杯體積的1/3即可蓋好玻璃杯蓋，固定好帶桿葉片刀，緩慢調(diào)整旋轉(zhuǎn)速度，一般開機(jī)數(shù)十秒后，組織細(xì)胞即可被高速旋轉(zhuǎn)的葉片刀破碎。但不宜時(shí)間過長，以防高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生熱而導(dǎo)致分離物中的活性物降解，用冷卻水降溫更好。
(3)超聲波處理法：超聲波發(fā)生器能產(chǎn)生高強(qiáng)度的超聲信號(hào)，經(jīng)換能器傳送至與之接觸的溶液中，由聲波形成沖擊和振動(dòng)而產(chǎn)生剪力，致使細(xì)胞破碎，動(dòng)物組織肝、腎、胸腺、淋巴結(jié)、腹水細(xì)胞、紅細(xì)胞、體外培養(yǎng)的細(xì)胞均可在短時(shí)間內(nèi)破碎，因超聲時(shí)可產(chǎn)熱，應(yīng)注意冰浴冷卻，生物大分子如核酸和酶對超聲敏感，一般不宜采用。
(4)化學(xué)裂介法：在細(xì)胞懸液中加入Triton-100、NP-40、SDS，去氧膽酸鈉均可使細(xì)胞裂解，往往仍需機(jī)械去輔助，方可在短時(shí)間內(nèi)使細(xì)胞*裂解，裂解后應(yīng)清除化學(xué)裂解劑，以防止干擾分析。
(5)反復(fù)凍融法：組織細(xì)胞濃液在-70℃或液氫中冷凍后，于37℃融化，經(jīng)3-4次凍融周期，可使細(xì)胞破碎。
另外，部分細(xì)胞器的分離一般采用差速離心或密度梯度離心的方法得到分離細(xì)胞器。
四、具體細(xì)胞器的分離方法選用：
(1)細(xì)胞膜的分離：細(xì)胞膜又稱質(zhì)膜，分離細(xì)胞膜有助于研究生物膜的結(jié)構(gòu)與功能。一般說，紅細(xì)胞膜與線粒體膜的制備用差速離心法即可，其他細(xì)胞膜的分離可根據(jù)膜組分的密度大小不同，采用梯度離心后，分布于區(qū)域，可分離得到純制品。
(2)線粒體的分離：線粒體普遍存在于真核細(xì)胞中，它是細(xì)胞呼吸的主要場所，細(xì)胞活動(dòng)所需能量主要依靠在線粒體內(nèi)進(jìn)行氧化所產(chǎn)生的能，線粒體的分離主要靠差速分離。
(3)線粒體膜分離：線粒體膜分離方法主要是密度梯度離心。
(4)聚核糖體的分離：核糖體是由核糖酸和蛋白質(zhì)組成的核糖核酸蛋白顆粒，附著在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的稱固著核糖體，分散在細(xì)胞內(nèi)的稱游離核糖體，數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)核蛋白體聚在一起稱為聚核糖體，一般用差速離心法可分離出聚核糖體。
(5)微粒體分離：微粒體是一種脂蛋白所包圍的囊泡，含核糖核酸，蛋白質(zhì)和脂類，分離微粒體的方法是利用分級(jí)離心法，去掉細(xì)胞核和線粒體后，經(jīng)超速離心而制備。
(6)細(xì)胞核的分離：不同組織來源的細(xì)胞經(jīng)勻漿后，可用分級(jí)離心等方法將細(xì)胞核進(jìn)行分離純化。