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末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL法）檢測細(xì)胞凋亡
點(diǎn)擊次數(shù)：744 發(fā)布時間：2014-12-29
材料與試劑
1. TUNEL試劑盒：
①從瓶2中取出標(biāo)記液100μl分別作為兩個陰性對照。
②將瓶1的全部溶液50μl加入瓶2剩余的450μl標(biāo)記液中，使其成為500μl的TUNEL混合物。
2. POD轉(zhuǎn)換液（一旦溶解，儲存于4℃，不得再凍存）
3. 漂洗液：PBS
4. 固定液：4%多聚甲醛（用pH7.4的PBS配）。
5. 封閉液：0.3%H2O2 （用甲醛配）。
6. DBA:金屬增強(qiáng)底物劑。
7. 細(xì)胞透化液：0.1%Trition X-100（溶于0.1%檸檬酸鈉）。
8. 蛋白酶K：10～20μg/ml，溶于Tris-HCL，pH7.6）。
操作方法
1、貼壁細(xì)胞、細(xì)胞甩片的染色方法
固定：用新鮮配制的4%多聚甲醛室溫固定30min；
內(nèi)源性過氧化物酶的封閉：用PBS輕洗，放入封閉液中，室溫下孵育30min；
細(xì)胞透化：用PBS輕洗玻片，滴加透化液，冰上4℃孵育2min；
標(biāo)記：PBS洗兩次，將標(biāo)本玻片吹干，滴加50μl TUNEL反應(yīng)混合物（注意要在單層細(xì)胞上均勻分布TUNEL，為避免蒸發(fā)，將玻片置于濕盒中）；同時設(shè)立對照：
A）陰性對照：每一實(shí)驗(yàn)均應(yīng)設(shè)立對照，每孔加50μl標(biāo)記液（無末端轉(zhuǎn)移酶）代替TUNEL反應(yīng)混合物；
B）陽性對照：每一實(shí)驗(yàn)均應(yīng)設(shè)立對照，用微球核酸酶或DNA酶I處理已固定/透化的細(xì)胞（1μg～1mg/ml，室溫10min），以誘導(dǎo)DNA鏈斷裂。37℃孵育 30min；
PBS洗3次；
單個轉(zhuǎn)換和分析：標(biāo)本吹干，加50μl轉(zhuǎn)換POD（注意要在單層細(xì)胞上均勻分布POD，為避免蒸發(fā)，將玻片置于濕盒中）37℃ 30min，PBS洗3次，加50～100μl DAB底物液，室溫下孵育10min，PBS洗3次，加蓋玻片；
置于光學(xué)顯微鏡下觀察（在光學(xué)顯微鏡觀察前，亦可對標(biāo)本進(jìn)行反相染色）；
結(jié)果判斷
在光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核染成棕黃色，可見核形態(tài)呈碎點(diǎn)狀；在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞染成淡綠色熒光，凋亡細(xì)胞染成黃綠色熒光，凋亡細(xì)胞可見核小體。細(xì)胞玻片經(jīng)過POD轉(zhuǎn)換后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核染成棕黃色，可見核形態(tài)呈碎點(diǎn)狀。
2、石蠟切片的染色方法
按常規(guī)步驟脫蠟、再水合（按HE染色的脫蠟、水合方法）；
滴加蛋白酶K于組織片上，作用30min，PBS洗2次；
其他染色步驟見：細(xì)胞染色步驟②～⑦；
結(jié)果分析：同上。
3、冰凍切片的染色方法
用4%多聚甲醛固定組織30min，PBS沖洗（注意：儲存時可用無水乙醇固定組織2 min，然后存于-20℃保存）；