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公司動態(tài)

GST-融合蛋白的表達與純化

點擊次數(shù):510 發(fā)布時間:2015-4-14

原理

 GST 純化系統(tǒng)是利用GST (glutathione-S-transferase )融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價親和,通過GSH交換洗脫的原理來進行純化 。1ml樹脂大約可結合5-8 mg融合蛋白,并可反復使用數(shù)次。試劑u IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷) 2g IPTG 溶解入10ml 水,過濾除菌,分裝,-20℃保存。u Lysis buffer (50ml)1)2.5ml 1 M Tris,pH8.0 2)0.1ml 0.5ml EDTA 3)0.292g NaCl4)0.5ml Triton X-100 5)0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1)0.615g glutathione 2)10 ml 1M Tris,pH8.0 3)90ml distilled water .

操作步驟

1)挑一個克隆至2ml LB液中(Amp+ )

2)37℃振搖至OD600值約為0.6

3)將2ml菌液加入100 ml LB中

4)37℃振搖至OD600值約為0.6

5)加入IPTG至終濃度為1mM

6)繼續(xù)搖3~4h

7)離心(5000 rpm,5min,4℃)

8)用10×柱體積的lysis buffer懸浮細菌

9)超聲破碎細胞

10)離心(12,000rpm,15min,4℃),取上清

11)用濾紙過濾

12)加0.5 ml 50%谷胱甘肽瓊脂糖beads于層析柱

13)5×柱體積的lysis buffer洗層析柱

14)樣品過柱

15)5×柱體積的lysis buffer洗層析柱

16)3×柱體積的elution buffer洗脫蛋白

17)收集蛋白:0.5ml/管 18)取20ml樣品SDS-PAGE鑒定可以在buffer里增加點蛋白酶抑制劑,防止蛋白的降解。

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