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蛋白質(zhì)組分析中的初步分離
點擊次數(shù)：619 發(fā)布時間：2015-5-25
在分析質(zhì)譜產(chǎn)生的二維圖譜上的蛋白質(zhì)斑點時，看起來似乎只有通常含量比較高的蛋白質(zhì)(編碼偏倚指數(shù)大于0.2)才能*被鑒定出來。因而，二維膠上的斑點數(shù)量不能代表可以分析的全部表達的基因的數(shù)量或種類。
Gygi等(2000)曾經(jīng)計算過，在二維作圖的早期階段，如果只裝入40ug酵母溶出產(chǎn)物，那么只有豐度超過至少51 000拷貝(每個細胞)的多肽才能被檢測到。如果起始的蛋白質(zhì)總量是0.5mg，那么豐度超過1000拷貝(每個細胞)的蛋白質(zhì)就可以通過銀染看到，但是那些每個細胞含100拷貝和10拷貝的都不能再現(xiàn)出來。由此作者得出結(jié)論：蛋白質(zhì)表達水平的參差不齊限制了二維MS手段分析中等豐度和低豐度蛋白質(zhì)的能力，因而這項技術(shù)在蛋白質(zhì)組分析方面的潛力同樣受到了限制。
這是一個嚴(yán)重的限制，因為現(xiàn)在丟失的蛋白質(zhì)組的那部分蛋白質(zhì)，從理解細胞和調(diào)控蛋白的角度來說很有可能就是zui令人感興趣的蛋白質(zhì)，因為這些低豐度的多肽鏈通常都是調(diào)控蛋白。
突破這種僵局的一條途徑是初步分離。在目前，經(jīng)常介紹的有兩類主要處理手段：色譜和電泳。Fountoulakis的研究組廣泛地研究了*種處理手段。在*道工序中，F(xiàn)ountoulakis等人(1997)與Fountoulakis及Takacs(1998)將肝素凝膠親和色譜作為一個初步分離步驟應(yīng)用于流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的蛋白質(zhì)組分的富集。然后將流感嗜血桿菌的溶出產(chǎn)物用基于多緩沖液交換器的聚焦層析來進行初步分離(Fontoulakis等，1998)。在另外一種工序中，F(xiàn)ountoulakis和Takacs(1999)利用基于TSK苯柱的疏水作用色譜法(hydrophobic interactionchromatography，HIC)來對流感嗜血桿菌的胞漿可溶蛋白進行初步分離。
在另外一個變通的處理過程中，F(xiàn)ountoulakis等人(1999)報道了利用羥基磷灰石色譜對萬．coli的低豐度蛋白質(zhì)進行了富集。所有這些不同的色譜方法都使得幾百種蛋白質(zhì)能夠被發(fā)現(xiàn)和描述。這些蛋白質(zhì)在原來的未分離溶出產(chǎn)物中是存在的，但因為濃度太低以至于檢測不到。
在電泳初步分離方面，zui有效的一個處理工序是基于多槽電解儀(multicompartmenectrolyser，MCE)的設(shè)備，這種儀器是Righetti等人設(shè)計的(1990)。這個方法依賴于等電膜，并采用與IPG分離同樣的固定相化學(xué)物質(zhì)進行分離(Righetti，1990)。這樣一個處理工序的優(yōu)勢很明顯，有如下幾點。
基于多槽電解儀的樣品預(yù)分離示意
右上圖顯示的是一張未分離的人血清的二維圖譜，相對的是三個等點聚焦分離的不同的二維圖譜，樣品分離是在膜中實現(xiàn)的，這些膜的p/值分別為：3.0～5.0、 5.0―6.0和6.0～10.5
①它提供了一種與隨后的*維分離*兼容的方法，而且其聚焦步驟基于固定化電解質(zhì)技術(shù)。
②它能在任意窄pH梯度的IPG條上收獲p/值與IPG條上的pH匹配的蛋白質(zhì)種群。
③作為②的必然結(jié)果，蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀的機會大大減少(實際上，在一個比較寬的梯度范；圍內(nèi)分析全細胞裂解液時，確實有較少的蛋白質(zhì)沉淀的風(fēng)險；相反，同樣的混合物在一個窄的梯度分析時，所有非等電蛋白質(zhì)的大規(guī)模沉淀可能發(fā)生，同時有很大的蛋白質(zhì)共沉淀風(fēng)險，除非聚焦在一個窄的pH間隔)。
④因為存在這樣一個事實，即只有在同樣的IPG間隔上共聚焦的蛋白質(zhì)才能出現(xiàn)；所以可以處理更大量的樣品，這樣就能夠檢測到低豐度蛋白質(zhì)。
⑤在含有蛋白質(zhì)濃度范圍的樣品中(如人血清，其中一個白蛋白占據(jù)了全部組分的60％以上)，應(yīng)該裝配一個足夠窄的等電條，以至于可以僅從混合物中除去不想要的蛋白質(zhì)，這同樣可以做到裝載更大量的樣品，而不與zui大豐度的分子種類發(fā)生干擾。
⑥Herbert和Righetti(2000；Righetti，Castagna和Herbert，2001)已經(jīng)將圖5.5描述的設(shè)備小型化了。在這個特別案例中，一個具有5個槽的組織結(jié)構(gòu)被4個膜分隔，這4個膜的p/值分別為3.0、5.0、6.0和10．5，選擇這樣的目的是將白蛋白這個人類血清中zui豐富的蛋白質(zhì)引到一個窄p/的中間槽中。這樣可以濃縮其他組分，以檢測到更多的、在pH的其他區(qū)域稀釋的成分。由于正確地利用了這種初步分離的設(shè)備，可以捕獲和檢測到更多的、“看不見的"酵母膜蛋白組(Pedersen等，2003)。
這些發(fā)現(xiàn)的重要性是很明確的：內(nèi)在膜蛋白在二維圖譜上很少看到；編碼偏倚指數(shù)(codonbias index，CBl)小于0．2代表的是低豐度蛋白，它們在二維圖譜上也幾乎檢測不到，除非采用某些初步分離方案先進行富集。編者的方法不僅依賴于初步分離步驟，而且還解決了完整蛋白質(zhì)的分析問題，又不止于分析蛋白酶解產(chǎn)物。按照慣例，大多數(shù)處理方案需偶聯(lián)色譜處理過程，但編者的方法其效果從圖5．6就可以看出來。在酵母中，還原型輔酶I―細胞色素b5還原酶有兩種形式，一種稱為p34(pi8.7，分子質(zhì)量34kDa)，另外一種是p32(pJ7.8，分子質(zhì)量30kDa)。*個組分是一個完整外膜蛋白，它介導(dǎo)細胞色素b5的還原反應(yīng)；第二個組分是*個組分經(jīng)過體內(nèi)的蛋白酶裂解得到的，是可溶的，并居于內(nèi)膜空間。編者的富集方案結(jié)合了對所有完整多肽鏈的二維分析，*可以檢測到這兩個組分。另外，編者可以很容易地觀察到p34鏈的兩個異構(gòu)體，其中一個的p／值是8.，另外一個更堿性，pJ值是9.1。色譜技術(shù)如果只依賴于全細胞消化產(chǎn)物中的一個(或少數(shù)幾個)多肽的出現(xiàn)，將不能檢測這些多肽的其他生物相關(guān)的形態(tài)。
酵母膜蛋白的初步分離和富集以及p34還原型輔酶I―細胞色素b5還原酶的截斷體和異型體的檢測。