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蛋白質(zhì)凝膠電泳的操作方法
點(diǎn)擊次數(shù)：764 發(fā)布時(shí)間：2015-6-17
【材料與試劑】
（1）2×SDS凝膠加樣緩沖液
（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳槽和電泳儀
（3）加樣器和吸頭等
（4）水浴鍋
【操作方法】
（1） 把上述處理的樣品按1:1（V/V）與2×SDS凝膠加樣緩沖液混合，100℃加熱3分鐘，使蛋白質(zhì)變性；
（2） 取出變性蛋白質(zhì)，立即放于冰上。樣品如粘稠可進(jìn)行超聲對(duì)DNA進(jìn)行剪切，以zui大功率處理0.5～2分鐘應(yīng)能有效地將裂解液粘稠度降至可控水平（注意：此步驟一定要在冰上進(jìn)行）；
（3） 如有沉淀以10 000g將樣本4℃離心10分鐘，將上清液移至另一管中，棄去沉淀物；
（4） 計(jì)算使用Western印跡法檢測(cè)靶蛋白所需要的樣本量，一般Western印跡法技術(shù)檢測(cè)中等大小蛋白的檢出下限約為1～5ng。在厚0.75mm的SDS聚丙烯酰胺凝膠上，每個(gè)泳道可加樣100μg而不致過(guò)多；
（5） 用玻璃微量進(jìn)樣器按順序加樣，注意沿加樣孔底上樣，否則樣品容易漂走。加樣量不宜過(guò)多或過(guò)少，一般15～20ul為宜。沒(méi)上樣的加樣孔中加1?SDS凝膠加樣緩沖液；
（6） 用注射器排除兩玻璃板底部的氣泡，將電泳裝置接通電源（正極接下槽，負(fù)極接上槽），凝膠上所加電壓為8v/cm,當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后，電壓可提高到15V/cm,繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部（約4小時(shí)），關(guān)閉電源；
（7） 從電泳裝置上卸下玻璃板，放入一瓷盤(pán)中，用一注射器吸取若干毫升電泳緩沖液，將針頭插入一玻璃板與凝膠之間，小心不要將凝膠刺破，沿玻璃板從左至右注入電泳緩沖液，將玻璃板與凝膠分開(kāi)?？拷筮吳腥ヒ唤且詷?biāo)明凝膠的位置；
（8） 如不需做免疫檢測(cè)可直接用考馬斯亮藍(lán)染色，做免疫檢測(cè)可按以下步驟進(jìn)行。