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蛋白質(zhì)組學(xué)同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽方法
點(diǎn)擊次數(shù)：698 發(fā)布時(shí)間：2015-6-23
他們提出使用一種試劑，這種試劑能夠使兩種同位素在形式上具有明顯的區(qū)別，即同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽(isotopicallycodedaffinitytag，ICAT)試劑。ICAT試劑的結(jié)構(gòu)包含一個(gè)生物素頭部、一個(gè)連接部分和一個(gè)碘激活的羰基基團(tuán)，這個(gè)羰基基團(tuán)能夠特異性地與半胱氨酸側(cè)鏈反應(yīng)。重同位素的形態(tài)與輕同位素的形態(tài)的差別相當(dāng)于在連接區(qū)部分的8個(gè)氫原子被8個(gè)氘原子取代。
ICAT方法
這種方法的設(shè)計(jì)目的是比較一對(duì)生物樣品。兩個(gè)蛋白質(zhì)樣品(細(xì)胞狀態(tài)I和細(xì)胞狀態(tài)Ⅱ)分別單獨(dú)用d0 ―ICAT和d8―ICAT試劑標(biāo)記，然后混合，并用胰蛋白酶水解。然后將肽混合物送至生物素―親和色譜柱分析。這一步驟通過(guò)分離和對(duì)含半胱氨酸殘基肽的洗脫來(lái)完成對(duì)肽混合物的簡(jiǎn)化。洗脫步驟與能夠進(jìn)行質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜的儀器偶聯(lián)。一對(duì)不同標(biāo)記的肽幾乎在相同的時(shí)間洗脫，可以通過(guò)兩個(gè)距離為8kDa的質(zhì)譜信號(hào)識(shí)別出來(lái)。因?yàn)轭A(yù)計(jì)d0 修飾的肽和d8修飾的肽的電離性質(zhì)是相同的，所以在每一個(gè)肽上都可以完成相對(duì)定量。一旦發(fā)現(xiàn)一對(duì)呈現(xiàn)“差別表達(dá)"的肽，就可以明確地進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜來(lái)鑒定此肽。
這種技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)比MuDPIT方法得到的數(shù)據(jù)少，能夠直接相對(duì)定位二元比較的肽。由于14％的真核蛋白質(zhì)沒(méi)有半胱氨酸殘基，這使得這項(xiàng)技術(shù)不適用于這些蛋白質(zhì)。對(duì)于基于2D―PAGE的方法難以處理的小的、大的、酸性的、堿性的和疏水的蛋白質(zhì)，這項(xiàng)技術(shù)與MuDPIT方法比基于2D―PAGE的方法有相似的優(yōu)勢(shì)。它們也有某些共同的劣勢(shì)，如不能獲得*蛋白質(zhì)的信息、處理過(guò)程的信息、翻譯后修飾的信息以及混合物中翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度的信息。
為了整合這項(xiàng)技術(shù)和2D―PAGE方法的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)在開(kāi)發(fā)了一種新的試劑，這種試劑稱為可裂解的ICAT。此試劑可以與用于2D―PAGE的二元混合物的試劑兼容。這種試劑已由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司投放市場(chǎng)。