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目的基因的亞克隆
點(diǎn)擊次數(shù)：702 發(fā)布時(shí)間：2015-8-28
所謂亞克隆就是對(duì)已經(jīng)獲得的目的dna片段進(jìn)行重新克隆，其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析，或者進(jìn)行重組改造等。
亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；(4)重組子篩選。
一、試劑準(zhǔn)備
1．LB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨（細(xì)菌培養(yǎng)用）10g，酵母提取物（細(xì)菌培養(yǎng)用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，*溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。
2．1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基: 稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高壓滅菌20min，稍冷卻，制備平皿。
3．IPTG、X-Gal
4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高壓滅菌20min，0℃冰浴備用。
5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高壓滅菌20min，0℃冰浴備用。
6．限制性核酸內(nèi)切酶、T4 dna連接酶。
二、目的DNA片段和載體的制備
選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA，用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈?，分別產(chǎn)生對(duì)稱性粘性末端（用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突出端）、不對(duì)稱粘性末端（用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端）、平端。在亞克隆時(shí)，不對(duì)稱相容末端連接，次選對(duì)稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時(shí)目的片段的末端與載體不匹配 ，一般先將不匹配末端補(bǔ)平，然后再以平末端連接。（實(shí)驗(yàn)操作同前述）
三、利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA片段和載體的體外連接
（一）連接要求和結(jié)果
外源DNA片段末端性質(zhì) 連接要求 連接結(jié)果
不對(duì)稱粘性末端 兩種限制酶消化后，需純化載體以提高連接效率 載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)?？杀Ａ簦环侵亟M克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。
對(duì)稱性粘性末端 線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理 載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)?？杀Ａ簦恢亟M質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；外源DNA會(huì)以兩個(gè)方向插入到載體中。
平端 要求高濃度的DNA和連接酶 載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)消失；重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；非重組克隆的背景較高 。
帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中,但是在連接反應(yīng)時(shí),外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè)DNA 的濃度，以便使“正確"連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到*水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團(tuán)以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的DNA片段和載體的體外連接反應(yīng)，也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價(jià)鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個(gè)新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個(gè)新的磷酸二酯鍵，此時(shí)產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個(gè)單鏈缺口，在導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。
（二）T4 DNA連接酶對(duì)目的DNA片段和載體連接的一般方案
1．連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
2．10μl體積反應(yīng)體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為1∶1-1∶5），補(bǔ)足ddH2O 至8μl。
3．輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。