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提取蕨類植物蜈蚣草總RNA 的一種有效方法
點擊次數(shù)：615 發(fā)布時間：2015-10-26
摘要 介紹了一種提取蕨類植物蜈蚣草(Pteris vittata L.)總RNA的有效方法。由于蜈蚣草富含多酚和多糖，用普通的RNA提取方法很難獲得高質(zhì)量的RNA。本方法通過優(yōu)化提取緩沖液的條件來抑制多酚氧化，并利用RNA與多酚、多糖在不同濃度的2-丁氧乙醇中溶解度不同的特性來去除多酚和多糖。
本方法簡便、快速，所提取的RNA質(zhì)量較高，可直接用于cDNA合成、cdna文庫的構(gòu)建以及RACE等分子生物學(xué)操作。
關(guān)鍵詞 蜈蚣草，蕨類植物，多酚，多糖，RNA提取
An Effective Method of Total RNA Isolation from a Fern plant — Pteris vittata L.
HE Zhen-Yan XU Wen-Zhong YANG Xue-Xi MA Mi②
(Key Laboratory of Plant Photosynthesis and molecular Environmental Physiology, Institute of Botany, the
Chinese Academy of sciences, Beijing 100093)
Abstract Here we reported on an effective method for total RNA isolation from a fern plant,Pteris vittata L. This method inhibits the oxidation of polyphenols by optimizing the conditions of the extraction buffer. Most of the polysaccharides and polyphenols extracted with nucleic acids are removed by taking advantage of differences in solubility of these compounds in the solvent 2-butoxyethanol. The whole process can be completed with a convenient manipulation in less than 2 hours. Isolated RNA has high purity and yield, and can be used for molecular manipulation such as the cDNA synthesis, cDNA library construction and RACE.
Key words Pteris vittata L., Fern, Polysaccharides, Polyphenols, RNA isolation
2001 年，《Nature》報道了世界上發(fā)現(xiàn)的*種砷超富集植物(hyperaccumulator)——蜈蚣草(Pteris vittata L.)(Ma et al., 2001)。蜈蚣草屬蕨類植物門、鳳尾蕨科、鳳尾蕨屬，廣布于我國長江以南各地區(qū)。zui近越來越多的研究顯示, 蜈蚣草和其他一些蕨類植物所具有的特性對于土壤砷污染的治理和植物砷抗性機制的研究都具有十分重要的意義(陳同斌等, 2002; Raab et al., 2004)。然而到目前為止，國內(nèi)外尚無蜈蚣草砷抗性分子機制研究的報道。其他蕨類植物有關(guān)分子生物學(xué)的研究資料也很少。RNA提取是進行分子生物學(xué)研究的必要前提。由于蜈蚣草富含多酚和多糖，普通的RNA提取方法(如鹽酸胍法和TRIZOL法等)很難獲得高質(zhì)量的RNA。在對多種RNA 提取方法進行比較和改進的基礎(chǔ)上(Manning, 1991；Schneider et al., 1991；Sharma et al., 2003；Zhang et
al., 2003)，我們摸索出一種提取蕨類植物蜈蚣草總RNA 的有效方法。用該方法提取的RNA可直接用于cDNA 合成、cDNA 文庫構(gòu)建以及RACE 等分子生物學(xué)操作。
1 材料與方法
1.1 實驗材料和試劑
蜈蚣草(Pteris vittata L.)采自我國湖北礦區(qū)，移栽在溫室培養(yǎng)。取幼嫩葉片作為RNA提取材料。
各種試劑均為RNA實驗。TRIZOL購于Invitrogen公司；Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit 和 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 購于Clontech 公司。
1.2.1 改進的RNA提取法 將0.5 mL 提取緩沖液(100 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.3；500mmol.L-1 EDTA，500mmol.L-1 NaCl； 2%SDS; 5 mmol.L-1 DTT, pH 8.3)加入到1.5 mL離心管中, 加入1.5%(V/V)β - 巰基乙醇。將
100 mg新鮮的蜈蚣草葉片用液氮冷凍研磨后,迅速轉(zhuǎn)到溫浴的緩沖液中，劇烈震蕩離心管，使組織與提取液充分混勻；70 ℃溫浴6 分鐘, 迅速置于冰上。待冷卻后，12 000 g離心10 分鐘，小心取出上清液；向上清液中加入0.1 mL 5 mol.L-1 NaCl， 混勻后，加入1/2體積的水飽和酚和1/2體積的氯仿,在旋渦振蕩器上劇烈振蕩2 分鐘， 12 000 g 離心10 分鐘,小心取出上清液。向上清液中加入1/4體積的2-丁氧乙醇和1.5%(V/V)的β-巰基乙醇，混勻，冰浴10 分鐘；12 000 g 離心10 分鐘，小心取出上清液；向上清液中加入1 體積的2-丁氧乙醇和1.5%(V/V)β-巰基乙醇，充分混勻后靜置10 分鐘，12 000 g 離心10 分鐘，倒掉上清液。用50% 的2- 丁氧乙醇洗滌沉淀2 次，加入適量的DEPC 處理水溶解RNA。
1.2.2 硫氰酸胍一步法提取總RNA 參考《分子克隆實驗指南》的方法(Sambrook et al., 1992)。
1.2.3 TRIZOL法提取總RNA TRIZOL總RNA 提取試劑盒購于Invitrogen 公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。
1.3 RNA質(zhì)量檢測
用紫外分光光度計檢測RNA 純度和濃度, 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性。
1.4 cDNA文庫構(gòu)建
以1.2.1節(jié)中所述方法分別制備經(jīng)砷誘導(dǎo)的處理和對照的RNA，并構(gòu)建差異表達的SSH(suppressive subtraction hybridization)cDNA文庫(按試劑盒提供的方法操作)。合成的cDNA 質(zhì)量可以驗證RNA 的質(zhì)量。