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真核細(xì)胞總RNA的提取與鑒定
點(diǎn)擊次數(shù)：1002 發(fā)布時(shí)間：2015-11-12
RNA的制備與分析對(duì)于了解基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)是*的,也是zui常使用的通過(guò)cDNA途徑分析細(xì)胞基因表達(dá)的前提。通常一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μg RNA，但其中大部分為rRNA及由tRNA，而mRNA僅占1%～5%。雖然mRNA大小和序列各不相同，但在多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3’末端都帶有一段較長(zhǎng)的多腺苷酸鏈。這個(gè)群體編碼了所有由該細(xì)胞合成的多肽。RNA分析其實(shí)是對(duì)組織細(xì)胞總RNA中的mRNA進(jìn)行分析。zui常用的方法主要有:原位雜交、RT-PCR、Northern ,另外還有: Sl 核酸酶作圖分析、引物延伸法等。在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,zui關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定,一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過(guò)程中的降解,而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果,所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實(shí)驗(yàn)中,一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要zui大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活,如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等,也可存在于灰塵中。在其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會(huì)造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶。
一、防止rna酶污染的措施
1．所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長(zhǎng)時(shí)間。
2．塑料器皿可用01%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。
3．有機(jī)玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。
4．配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1% DEPC在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng) 濾膜過(guò)濾除菌。
5．操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。
6．設(shè)置RNA操作實(shí)驗(yàn)室,所有器械等應(yīng)為。
二、 常用的RNA酶抑制劑
1．焦磷酸二乙酯 是一種強(qiáng)烈但不*的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的瞇唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,從而抑制酶的活性。
2．異硫氰酸胍 目前被認(rèn)為是zui有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái),又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
3．氧釩核糖核昔復(fù)合物由氧化釩離子和核昔形成的復(fù)合物,它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì),幾乎能*抑制RNA酶的活性。
4．RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin) 從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,可以和多種RNA酶結(jié)合,使其失活。
5．其他 SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。
一、組織和細(xì)胞總RNA提取—異硫氰酸胍法
【操作】
1．樣品處理
(1)培養(yǎng)細(xì)胞 收集細(xì)胞1～2×107，離心,5000g×5min。對(duì)于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1Od離心管中；懸浮培養(yǎng)細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)移離心管；離心, 5000g×5mim PBS洗滌2次。棄上清,置冰浴。加預(yù)冷變性液2ml,充分搖動(dòng),使細(xì)胞裂解*。以下操作均在冰浴中進(jìn)行。
(2) 組織 取1～2g組織(新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可)置組織勻漿器中,加入預(yù)冷的變性液12ml,在冰浴中充分勻漿。