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質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定
點擊次數(shù)：768 發(fā)布時間：2015-12-2
實驗?zāi)康模毫私庹莆諜z測DNA 質(zhì)量的方法以及DNA定量的方法；了解影響DNA在瓊脂糖凝膠中泳動速率的因素；訓(xùn)練DNA的瓊脂糖凝膠電泳操作及DNA的限制性內(nèi)切酶操作。
實驗原理：參見系列一中實驗二；限制性內(nèi)切酶的特點：見“基因操作原理”。
實驗材料及試劑：水稻總DNA或BAC克隆DNA，瓊脂糖，限制性內(nèi)切酶DraI，EcoRI，EcoRV，HindIII
實驗步驟：
1．取10µl DNA于0.8% 凝膠檢測；
2．將DNA調(diào)節(jié)濃度至300-400 ng/µl ；
2．仔細(xì)閱讀將所用的任何一種酶產(chǎn)品說明書，熟悉反應(yīng)條件及酶切的貯存濃度（10U-50U/µl）廠家配套試劑；
3．計算據(jù)反應(yīng)條件所需要的各種試劑準(zhǔn)確用量：（0.5 ml tube中）
DNA(3-5µg) 10µl
10´ buffer reaction 1.5µl
enzyme (15 U/µl) 0.8µl（冰上）
ddH2O 2.7µl
混勻，短暫離心；
4．37℃ 溫浴1-2 hrs (純DNA) 或10 hrs（粗制DNA）；
5．加入上樣緩沖液終止酶切反應(yīng)，也可65℃加熱10 min使酶變性失活；
6．電泳檢測酶切效率：
每個樣品取1/10量用瓊脂糖電泳檢測，制膠及點樣方法同上。
結(jié)果分析
若水稻DNA呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則需重做；
DNA被切爛：DNA降解，重新提DNA；
DNA切不動：雜質(zhì)多（多糖，蛋白質(zhì)，酚類，有機(jī)溶劑等），重新純化；
若是BAC克隆DNA，酶切后應(yīng)出現(xiàn)多條很清晰的不同大小DNA帶。