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RAPD[隨機擴增多態(tài)性DNA]分析技術(shù)
點擊次數(shù)：795 發(fā)布時間：2015-12-16
1 導論
聚合酶鏈式反應（PCR）以其*性極大地影響到了分子生物學的幾乎所有領域，并以其基本程序和DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis），開發(fā)出多種檢測核苷酸變異的方法。RAPD（Random Amplifed Polymorphic DNA）就是其中的一種，它是1990年美國杜邦公司科學家J. G. K. Williams和加利福尼亞生物研究所J. Welsh領導的兩個小組幾乎同時發(fā)展起來的一項新技術(shù)。Williams稱之為RAPD，Welsh叫它AP-PCR（Arbitrary Primer PCR）（Welsh J et al, Nucl Acids Res, 1990(18):7213; Williams J G K et al, Nucl Acids Res, 1990(18):6531）。與常規(guī)PCR相比，RAPD主要有以下的自身特點：①無需專門設計RAPD擴增反應的引物，也無需預知被研究的生物基因組核苷酸順序，引物是隨機合成或是任意選定的。引物長度一般為9～10個寡核苷酸。②每個RAPD反應中，僅加單個引物，通過引物和模板DNA鏈隨機配對實現(xiàn)擴增，擴增沒有特異性。③退火溫度較低，一般為36℃，這能保證短核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對，同時也允許了適當?shù)腻e誤配對，以擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性。④較之常規(guī)PCR，RAPD反應易于程序化。利用一套隨機引物，得到大量DNA分子標記，可以借助計算機進行系統(tǒng)分析。
RAPD作為單引物的PCR擴增產(chǎn)物，其產(chǎn)生機理是引物首先結(jié)合到模板鏈，沿模板5’端方向延伸而產(chǎn)生不同長度的DNA片段，然后以這些片段為模板繼續(xù)大量擴增。由于RAPD反應中，在3’端沒有相應引物和模板互補，這樣必然存在一個由引物沿模板DNA 5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互補序列的過程。有人提出，在RAPD反應過程中，擴增可能存在一些這樣的分子模式：①5’端帶有引物的單鏈DNA分子在3’端發(fā)生折轉(zhuǎn)、自身結(jié)合和延伸，并在3’端形成同一引物的互補序列，變性展開后即可成為單引物PCR擴增的模板分子。②通過兩條5’端各帶同一引物的單鏈DNA分子拼聯(lián)來實現(xiàn)。③對基因組DNA分子的顛倒重復序列而言，如果引物的結(jié)合位置正好處于這些序列的3’端，那么在其DNA片段的兩條單鏈上就分別具有一個引物的結(jié)合位置和它互補的序列，成了RAPD擴增的模板分子。在雙引物通用PCR中這種情況很少，但由于RAPD所用引物短，又在低溫下退火，這增加了引物和顛倒重復序列結(jié)合的機會，*有可能產(chǎn)生RAPD。
2 試驗條件
【藥品試劑】
模板DNA（10～100ng）
寡核苷酸引物（20mmol/L貯存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司購買，也可以自己合成）
0.2 mmol/L dNTPs（必須使用高質(zhì)量的dNTPs，這一點非常重要。dNTPs經(jīng)反復化凍后會發(fā)生降解，因此應分成小份保存。應注意混合物中四種dNTP的量要相等）
taq dna聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut）
10×PCR緩沖液（500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl 2, 100 mmol/L Tris·HCl, pH 8.3）
礦物油
電泳所需試劑
【儀器設備】
PCR擴增儀
電泳裝置
微量離心機
微量移液器（1～20ml和20～200ml）
0.5 ml Eppendorf管
紫外線觀察裝置及照相設備
3 操作程序
1）在冰里向無菌的Eppendorf管中加入以下反應物：
水 14.75 ml
10×緩沖液 2 ml
10×dNTPs 2 ml
引物（20 mmol/L） 0.2 ml
Taq DNA聚合酶
終體積
DNA（10～100ng） 1 ml
石蠟油 20ml
（2）93℃反應2 min后開始如下循環(huán)：
93℃變性反應1min
36℃退火反應1min
72℃延伸反應1.5min
經(jīng)過45個循環(huán)后，zui后一個循環(huán)72℃增加5min，循環(huán)結(jié)束后反應產(chǎn)物置于4℃保存。
（3）20ml反應產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色檢測擴增的情況。