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基因與載體的重組（重組體的構(gòu)建）
點(diǎn)擊次數(shù)：627 發(fā)布時(shí)間：2016-2-22
目的基因與載體的重組（重組體的構(gòu)建）程序如下：
（1）質(zhì)粒dna的分離純化。一般含有單個(gè)目的基因的DNA片段，即使進(jìn)入了宿主細(xì)胞也不能進(jìn)行增殖。通常它需要同適當(dāng)?shù)哪茏晕覐?fù)制的DNA分子（例如質(zhì)粒、噬菌體DNA等）結(jié)合后，才能在通過轉(zhuǎn)化或其他途徑導(dǎo)入宿主細(xì)胞，像正常質(zhì)粒或病毒一樣增殖和易于檢測。分離質(zhì)粒載體DNA有許多方法，但其共同步驟是先用溶菌酶處理含有質(zhì)粒載體的宿主菌培養(yǎng)物，以除去其細(xì)胞壁，然后加入去污劑（例如SDS），使其發(fā)生溫和的溶菌作用。這樣質(zhì)粒DNA、多聚核糖體、可溶性蛋白質(zhì)、tRNA等細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)便逐步地釋放出來，而核染色體的DNA則仍然附著在細(xì)胞的殘?jiān)槠?，?jīng)過離心處理，可使其同質(zhì)粒分開。將離心所得的含有質(zhì)粒DNA的上清液，加酚處理除去蛋白。剩下的DNA混合物中，質(zhì)粒DNA（cccDNA）呈超螺旋狀態(tài)。為進(jìn)一步純化出cccDNA分子，可在含有溴化乙錠（EB）染料和氯化銫溶液中進(jìn)行密度梯度離心。EB是一種扁平分子，它能插入雙鏈DNA分子的兩個(gè)相鄰堿基對(duì)之間，從而降低了DNA分子在氯化銫中的密度。又由于cccDNA同EB的結(jié)合能力比開環(huán)DNA和線性DNA低得多，這樣在氯化絕密度梯度中便可容易地將cccDNA同其他兩種類型的DNA分離開來其他載體DNA分高純化的原理與上述類似。
（2）目的基因與載體的連接。外源DNA片段與載體DNA分子的連接，即DNA分子的體外重組，主要依賴于限制性內(nèi)切核酸酶及dna連接酶的作用。在進(jìn)行連接時(shí)，一般需要注意以下幾點(diǎn)：① 實(shí)驗(yàn)步驟盡可能簡單容易；② 在連接后，接點(diǎn)序列能被一定的限制酶重新酶切，以便回收插入片段；③ 對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不發(fā)生干擾。
連接方法一般有兩種。一種是用用兩種不同的限制酶同時(shí)酶解一種特定的DNA分子，產(chǎn)生具有兩種不同末端（粘性末端與另種粘性末端、粘性末端與平齊末端）的DNA片段，那么可實(shí)現(xiàn)外源DNA片段定向插入載體分子。另一種是非互補(bǔ)粘性末端DNA分子的連接。即在一定的反應(yīng)條件下，可用T4 DNA連接酶將平齊末端的DNA片段有效地連接起來；對(duì)于非互補(bǔ)粘性末端DNA分子，在用特異作用干單鏈DNA的s1核酸酶處理，使其變成平齊末端后，也可用 T4 DNA連接酶進(jìn)行有效的連接。另外，可采用附加銜接物（linker，是一種人工合成的雙鏈DNA短片段，其上具有一個(gè)或數(shù)個(gè)在將與其連接的載體DNA上不存在的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，可按平齊末端連接法給平齊末端片段加上相同識(shí)別位點(diǎn)的銜接物，再用在銜接物中具有識(shí)別位點(diǎn)的合適限制酶切割，用常規(guī)方法連接）的方法，提高平齊末端間的連接作用效率。也可利用接頭進(jìn)行DNA平齊末端門的連接。接頭（adaptor）是一種具有粘性末端的短核昔酸雙鏈，它與平齊末端連接后，不用經(jīng)過切割即可與載體相連。
為了使連接反應(yīng)物中盡可能多的外源DNA片段插入載體分子，以形成重組DNA，必須阻止在限制酶切割后線性載體分子的自身環(huán)化作用。具體可采用以下方法：
（1）用堿性磷酸酶處理限制酶酶解產(chǎn)生的線性載體分子。堿性磷酸酶可除去線性載體DNA分子的5¹-磷酸，而留下3¹-羥基基團(tuán)。經(jīng)過堿性磷酸酶處理的線性載體分子，除非插入外源dna片段，否則就不能重新環(huán)化為有功能的載體分子。
（2）采用同聚物加尾連接技術(shù)，可自動(dòng)防止線性載體DNA分子的自身環(huán)化作用，這是因?yàn)榍懈詈笮纬傻木€性DNA分子的兩個(gè)3¹-OH末端，此時(shí)都已被加上具有同樣堿基結(jié)構(gòu)的同聚物尾巴。
（3）應(yīng)用柯斯質(zhì)粒，也可防止質(zhì)粒DNA分子發(fā)生自身環(huán)化作用。需要指出的是，在連接反應(yīng)中，正確配加載體DNA與外源DNA間的比例，是獲得重組體的一個(gè)重要因素。在應(yīng)用λ噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體時(shí)，如果配置高比值的載體DNA/外源DNA的連接反應(yīng)體系，就有利于重組體分子的形成；在應(yīng)用質(zhì)粒作載體時(shí)，因?yàn)槠渲亟M體分子是由一個(gè)載體分子和一個(gè)外源DNA片段環(huán)化而成的，所以當(dāng)載體DNA與外源DNA的比例為1時(shí)，zui有利于重組體分子的形成。