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RNAi——制備siRNAs的幾種方法
點擊次數(shù)：537 發(fā)布時間：2016-3-21
越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs)來抑制特定的哺乳動物基因表達。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。RNAi的應用包括功能基因組學，藥物靶篩選，細胞信號傳導通路分析等等。
目前為止較為常用的5種制備sirnas的方法包括
化學合成
體外轉(zhuǎn)錄
長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. DICEr, E. coli, RNase III)
siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經(jīng)過轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉(zhuǎn)染到細胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點和缺點。哪種是的方法，其實取決于實驗目的。這里簡單介紹這5種方法，優(yōu)點和缺點，以及它們的應用。
siRNA的設計
除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列。關于怎樣設計siRNA以及siRNA設計對siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關設計原則的信息。但這仍然不是的。通常來說，每個目標序列設計3—4對siRNAs，在后面的實驗中選擇zui有效的那個。網(wǎng)上有提供免費的siRNA設計工具。
體外制備
1.化學合成
盡管化學合成是zui貴的方法，但是卻是zui方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出zui有效的序列再進行化學合成。
zui適用于：已經(jīng)找到zui有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究
不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素