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AFLP分子標記實驗
點擊次數：695 發(fā)布時間：2016-4-25
擴增片段長度多態(tài)性Amplified fragment length polymorphism（AFLP）是在隨機擴增多態(tài)性（RAPD）和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術上發(fā)展起來的DNA 多態(tài)性檢測技術，具有RFLP技術高重復性和RAPD技術簡便快捷的特點，不需象RFLP分析一樣必須制備探針，且與RAPD標記一樣對基因組多態(tài)性的檢測不需要知道其基因組的序列特征，同時彌補了RAPD技術重復性差的缺陷。同其他以PCR為基礎的標記技術相比，AFLP技術能同時檢測到大量的位點和多態(tài)性標記。此技術已經成功地用于遺傳多樣性研究，種質資源鑒定方面的研究，構建遺傳圖譜等。
其基本原理是：以PCR(聚合酶鏈式反應)為基礎，結合了RFLP、RAPD的分子標記技術。把DNA進行限制性內切酶酶切，然后選擇特定的片段進行PCR擴增(在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”，用與接頭互補的但3-端有幾個隨機選擇的核苷酸的引物進行特異PCR擴增，只有那些與3-端嚴格配對的片段才能得到擴增)，再在有高分辨力的測序膠上分開這些擴增產物，用放射性法、熒光法或銀染染色法均可檢測之。
一、 實驗材料
采用青稞葉片提取總DNA。
二、 實驗設備
1.美國貝克曼庫爾特CEQ8000毛細管電泳系統(tǒng)，
2.美國貝克曼庫爾特臺式冷凍離心機，
3.美國MJ公司PCR儀，
4.安瑪西亞電泳儀等。
三、 實驗試劑
1. 試劑：請使用高質量產品，推薦日本東洋坊TOYOBO公司的相關產品。
DNA提取試劑盒；
EcoRI酶,MseI酶，T4連接酶試劑盒；
Taq酶，dNTP, PCR reaction buffer；
AFLP引物；
瓊脂糖電泳試劑：瓊脂糖，無毒GeneFinder核酸染料替代傳統(tǒng)EB染料；
超純水（18.2MΩ·cm）
2．其他實驗需要物品
微量移液槍（一套）及相應尺寸Tip頭,PCR管,冰浴等。
四、 實驗流程
1、 總DNA提取
使用DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA，通過紫外分光光度計檢測或用標準品跑膠檢測。一般來說，100ng的基因組DNA作為反應模板是足夠的。
2、 EcoR1酶消化（20ul體系/樣品）
AFLP分子標記實驗
3、Mse1酶消化（20ul體系/樣品）
AFLP分子標記實驗
5、 預擴增（20ul體系/樣品）
sample 4ul
Primer(Mse1/EcoR1) 1ul
AFLP Core Mix 15ul
* AFLP Core Mix 配方：
ddH2O 13.8ul
MgCl2 1.6ul
dNTPs(2.5mM) 1.6ul
Taq酶(1U/ul) 1ul
10×Buffer 2ul