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植物基因組DNA的分離純化及RAPD擴增
點擊次數(shù)：472 發(fā)布時間：2016-5-23
1、植物基因組DNA的分離純化
一、實驗原理
核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA是雙鏈線性分子，原核生物的“染色體”、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子，有些噬菌體DNA有時為單鏈環(huán)狀分子。95%的真核生物DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，其它5%為細(xì)胞器DNA，如線粒體、葉綠體等。
從細(xì)胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開是技術(shù)的關(guān)鍵。
鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術(shù)之一。在制備核酸時，通常是用研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液這一性質(zhì)可以將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品破碎細(xì)胞液中分開。
分離得到核蛋白后，還需進一步將蛋白等雜質(zhì)除去。去除蛋白的方法有 3種：① 用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除 去變性蛋白質(zhì)。用這種方法處理時，蛋白質(zhì)停留在水相和氯仿相中間，而 DNA則溶于上層水相，用兩倍體積95%乙醇溶液可將DNA鈉鹽沉淀出來。② 用 十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性，從而使其與核酸分離，也可 從材料中直接提取出DNA。③ 用苯酚處理，然后離心分層，一樣可以將DNA 與蛋白質(zhì)分離開來。這時DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內(nèi)， 吸出上層水相，加入兩倍體積的95%乙醇即可得到白色纖維狀DNA沉淀。反復(fù) 使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質(zhì)較*地除去， 得到較純的DNA制品。本實驗采用CTAB法從植物幼苗中提取基因組DNA。
為了*除去DNA制品中混雜的RNA雜質(zhì)，可用RNA酶進行處理。另外， 生物材料中還含有大量的脂肪物質(zhì)和多糖，這些物質(zhì)在用鹽溶液分離核蛋白 和用乙醇或異丙醇分級沉淀時即可被除去。
核酸純化目標(biāo)：純化后的核酸樣品中不應(yīng)該存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的重金屬離子；其它生物大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降到zui低程度；排除RNA分子污染。
操作注意事項：盡量簡化操作步驟，縮短提取過程減少各種有害因素對核酸的破壞；減少化學(xué)因素對核酸的降解，一般pH4-10；減少物理因素如機械切力、高溫對核酸的降解。
提取步驟：破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子，去除RNA，去除鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)。方案：視具體的生物材料和待提取的核酸分子特點而定。
二、儀器設(shè)備
高速離心機、水浴鍋、電子天平、冰箱
三、材料及試劑
1. 材料：水稻幼苗
2. 試劑：
① 2×CTAB提取液(內(nèi)含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L EDTA、0.2%?-巰基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)：取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2ml?-巰基乙醇，加雙蒸水(ddH2O)定容到100ml；
② 氯仿:異戊醇(24:1)
③ 洗滌緩沖液(70%乙醇，內(nèi)含10mmol/L乙酸銨)：取70mL無水乙醇和0.077g乙酸銨，加雙蒸水定容到100ml；
④ 無水乙醇、70%乙醇；
⑤ TE緩沖液：內(nèi)含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0
四、操作步驟
① 取水稻幼苗，液氮研磨成粉，迅速分裝于Eppendorf 管中，加入0.7ml 60℃水浴中預(yù)熱的2×CTAB提取液和20ulb-巰基乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動使之混勻；
② 樣品于60℃溫浴45min，每5min將Eppendorf管上下顛倒混勻；
③ 加入等體積氯仿:異戊醇(24:1)，輕輕顛倒混勻，室溫下放置5min，6000g離心10min。
④ 上層溶液轉(zhuǎn)入另一個干凈Eppendorf 管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，混勻，６000g轉(zhuǎn)離心5min；
⑤ 重復(fù)步驟④ 2-3次，直至無白色界面物質(zhì) ；
⑥ 將上層水相吸入另一干凈的離心管中，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕輕混勻使核酸沉淀下來。在-20℃下放置30min，4℃、10000g轉(zhuǎn)離心10min，棄上清液；
⑦ 沉淀用加入1ml洗滌緩沖液，10000g離心1-2min；
⑧ 沉淀用無水乙醇洗1次， 10000g離心1-2min；
⑨ 沉淀置于空氣中3-5min，晾干后加入15-20 ul無菌水溶解；DNA含量測定及電泳檢測，瓊脂糖濃度為0.8%。
取2-5ulDNA溶液稀釋至100ul，于紫外核酸蛋白檢測儀上測定A260、A280和A320的OD值，并計算DNA濃度和得率。
注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm，在波長260nm紫外線下，1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1個OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50ug/ml，單鏈DNA或RNA為40ug /ml，單鏈寡核苷酸為20ug/ml。純的DNA的A260/A280在1.8左右。