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利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 指紋技術(shù)對(duì)豬鏈球菌進(jìn)行基因分型
點(diǎn)擊次數(shù)：566 發(fā)布時(shí)間：2016-5-30
豬鏈球菌病是由鏈球菌感染引起的豬的一類(lèi)疾病的總稱(chēng)。隨著我國(guó)工廠化養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展,豬鏈球菌病已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要疾病。該病一年四季均可發(fā)生,侵害不同年齡的豬,由于鏈球菌血清型多、抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜,在臨床上可呈現(xiàn)不同的特征,如敗血癥、腦膜腦炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、化膿性淋巴結(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、支氣管肺炎等,還常與其他疾病合并感染,發(fā)病率和死亡率較高 稍加改進(jìn)。
1. 4. 2 RAPD 反應(yīng)條件優(yōu)化及引物篩選 利用100 條隨機(jī)引物對(duì)20 株豬鏈球菌基因組DNA 進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增,將結(jié)果穩(wěn)定且有多態(tài)性的引物用作RAPD 分析。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,大致確定各組分的濃度后對(duì)各組分和反應(yīng)條件逐個(gè)進(jìn)行優(yōu)化,確定其*濃度和擴(kuò)增反應(yīng)條件。主要優(yōu)化了對(duì)RAPD 影響較大的2 個(gè)反應(yīng)參數(shù),即PCR 反應(yīng)體系中的Mg2 + 濃度(1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4.0、4. 5 mmol/ L) 和DNA 模板濃度(10、50、80、100、120、150、200 ng/μL) 。反應(yīng)體系為25μL ,內(nèi)含1. 5 U Taq 酶、10 mmol Tris2HCl 緩沖液(pH 8. 0) 、50 mmol KCl、0. 1 mmol dNTP 及8 pmol 隨機(jī)引物。PCR 反應(yīng)液覆蓋25μL 礦物油后進(jìn)行擴(kuò)增。94 ℃預(yù)變性5 min ,然后94 ℃反應(yīng)1 min ,35 ℃反應(yīng)1 min ,72 ℃反應(yīng)2 min。40 個(gè)循環(huán)后72 ℃保溫20 min ,以使延伸反應(yīng)充分完成。取15μL 擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/ L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),觀察結(jié)果。
1. 4. 3 RAPD 指紋圖譜分析 以所有分析菌株為變量,不同的擴(kuò)增產(chǎn)物為樣本,統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果。以遺傳距離為聚類(lèi)統(tǒng)計(jì)量,采用zui小距離法,經(jīng)SPSS 10. 0 軟件統(tǒng)計(jì)出各菌株的歐氏遺傳距離,并進(jìn)行聚類(lèi)分析,繪出親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。
2 結(jié)果
2. 1 RAPD 隨機(jī)引物篩選及反應(yīng)條件的優(yōu)化
在100 條隨機(jī)引物中有68 條引物有擴(kuò)增產(chǎn)物,其中10 條引物為單態(tài)性,27 條引物多態(tài)性較好。在RAPD 條件優(yōu)化中,發(fā)現(xiàn)Mg2 + 在2. 5 mmol/ L 時(shí)有較高的擴(kuò)增效率,且非特異性低; 當(dāng)Mg2 + 濃度降低時(shí),擴(kuò)增效率隨之降低;Mg2 + 濃度過(guò)高,非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。DNA 模板濃度在50 ng/μL 時(shí)有較好的擴(kuò)增結(jié)果,當(dāng)濃度較高時(shí),擴(kuò)增條帶模糊不清,甚至出現(xiàn)涂抹帶。
2. 2 RAPD 結(jié)果
100 條引物中,有32 條引物無(wú)法擴(kuò)出穩(wěn)定的帶型或無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。其中27 條引物可分別產(chǎn)生3～12 條片段,表現(xiàn)出較高的多態(tài)性,能應(yīng)用其分析的豬鏈球菌種內(nèi)的遺傳差異,從而對(duì)其分型。擴(kuò)增結(jié)果如圖1 和圖2。
利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 指紋技術(shù)對(duì)豬鏈球菌進(jìn)行基因分型
圖1 引物OPO20 擴(kuò)增結(jié)果
1～20 為試驗(yàn)時(shí)的菌株編號(hào),M為Marker
利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 指紋技術(shù)對(duì)豬鏈球菌進(jìn)行基因分型
圖2 引物OPM04 擴(kuò)增結(jié)果
1～20 為試驗(yàn)時(shí)的菌株編號(hào),M為Marker