1) 成功酶切的關(guān)鍵是準(zhǔn)備好模板DNA。DNA樣品中不能含有有機(jī)溶劑(會(huì)使酶變性或產(chǎn)生星號(hào)貨性)，不能含有干擾酶活性的污染物質(zhì)，不能含有高濃度的 EDTA (TE中的EDTA濃度較低，對(duì)Mg的濃度影響較小);同時(shí)要對(duì)DNA甲基化程度及其對(duì)酶切效率的影響要做到心中有數(shù)。

2) 選用合適的酶。根據(jù)酶切序列選用，特別注意選用甲基化對(duì)酶活性的干擾。

3) 正確使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低溫環(huán)境中，只是在需要用酶才從冰箱中取出來(lái)。運(yùn)輸和臨時(shí)存放時(shí)需要將酶至于冰上。手拿酶管時(shí)不要接觸酶管下步含酶的部分，移酶時(shí)盡可能用長(zhǎng)tip, 避免污染。用完后需要及時(shí)送回原處。注意：酶通常是zui后加。

4) 反應(yīng)體積需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，常?guī)的酶切一般要維持在10-50ul，酶切鑒定10-20ul就可以了。

5) 模板濃度問(wèn)題：濃度過(guò)高，溶液黏度過(guò)大，酶不能有效擴(kuò)散，酶切效果不會(huì)好。濃度過(guò)低，也會(huì)影響酶活性。

6) 注意模板用量和反應(yīng)體積的關(guān)系。對(duì)酶用量，模板用量，反應(yīng)體積等要素的確定需要的是時(shí)間和經(jīng)驗(yàn)的積累。

7) 酶切反應(yīng)的各個(gè)組分加完后，需要用TIP小心混勻幾次，short spin 一下就可以保溫了。一般不能使用振蕩器混勻。

8) 反應(yīng)溫度的選擇。一般反應(yīng)都用37度，但是 Sma I 的溫度是25度，37度時(shí)酶仍表現(xiàn)出活性，但是效率下降50%。部分從耐熱菌制備的酶需要在37度以上的溫度反應(yīng)，如taq I的zui適溫度為65度，37度保溫，效率僅為前者的1/10。

9) 反應(yīng)時(shí)間的選擇。一般酶切鑒定30分鐘就可以了。要*酶切可以采用少量的酶長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)，或較高的酶量短時(shí)間處理都可以達(dá)到。在使用高酶量的時(shí)候需要注意甘油的zui終濃度不要超過(guò)5%，也就是說(shuō)10ul的體系，酶的用量不要超過(guò)1ul。

10) 是否和如何終止反應(yīng)?酶切鑒定之類的實(shí)驗(yàn)不需要特殊處理。滅活的手段：加入高濃度的EDTA;65度或80度熱處理20-30分鐘;部分從高溫菌純化出來(lái)的內(nèi)切酶由于zui適的反應(yīng)溫度比較高，熱處理滅活不一定*，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法純化;電泳回收也是實(shí)驗(yàn)室常用除酶的手段。

2.如果遇到酶切不動(dòng)或切不*，該怎么辦?

要回答這么問(wèn)題常常需要了解酶活性單位是如何確定，我們多次接到這樣的問(wèn)題：1個(gè)單位的酶能在60分鐘內(nèi)切1ug的DNA,為什么我們的DNA那么少切那么長(zhǎng)時(shí)間也不能切開(kāi)或切*? 從下面幾個(gè)因素去考慮：

1) 酶是否有活性：酶的活性單位通常是在60分鐘酶切1ug lambda DNA或特定線狀DNA所需要的酶量。鑒定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是別的公司的酶來(lái)判定。因?yàn)椴煌久缚赡苁菑牟煌到y(tǒng)中純化的，雖然識(shí)別位點(diǎn)相同，但是酶的特性可能是有差異的。鑒定酶必須使用使用說(shuō)明書上認(rèn)定的酶活確定的方式，通常需要用lambda DAN做模板來(lái)判定。同時(shí)如果酶對(duì)甲基化敏感，還需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于運(yùn)輸或分裝不當(dāng)導(dǎo)致酶活性下降，這種情況是很少發(fā)生。我們公司銷售的SibEnzyme公司的酶，在分裝前嚴(yán)格檢驗(yàn)過(guò)，不合格的東西(很少)都退回原廠，所以不合格的產(chǎn)品是不會(huì)送到用戶手頭的。

2) 模板性質(zhì)是否清楚：如果 DNA的類型變了所需要的酶量也不同。酶切效果與DNA的性質(zhì)(線狀，超螺旋狀)、位點(diǎn)數(shù)目、位點(diǎn)左右的序列、甲基化程度、純度等有很大的關(guān)系。對(duì)超螺旋狀DNA*酶切所需要的酶量要比線狀的高好幾倍(在我們的目錄上有部分酶是有標(biāo)注的)，同時(shí)需要提高酶的用量(10U/ug)和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等措施。還有一個(gè)問(wèn)題是有些時(shí)候DNA是從別人那里得到的，背景不清楚也造成困惑。

1.如何做好酶切?

該問(wèn)題看似什么簡(jiǎn)單： DNA中加上酶，然后保溫一段時(shí)間就可以了。但是在實(shí)際操作過(guò)程中，我們不斷聽(tīng)到：切不動(dòng)，裝不上。問(wèn)題在什么地方?能系列生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶的公司上，就那么幾個(gè)，位列前3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。這些公司提供酶的品質(zhì)一般都能得到保證。您可以懷疑酶的質(zhì)量問(wèn)題，但是更多的問(wèn)題來(lái)源于模板是否合適酶切要求。下面幾點(diǎn)對(duì)你的酶切是有幫助的。

1) 成功酶切的關(guān)鍵是準(zhǔn)備好模板DNA。DNA樣品中不能含有有機(jī)溶劑(會(huì)使酶變性或產(chǎn)生星號(hào)貨性)，不能含有干擾酶活性的污染物質(zhì)，不能含有高濃度的 EDTA (TE中的EDTA濃度較低，對(duì)Mg的濃度影響較小);同時(shí)要對(duì)DNA甲基化程度及其對(duì)酶切效率的影響要做到心中有數(shù)。

2) 選用合適的酶。根據(jù)酶切序列選用，特別注意選用甲基化對(duì)酶活性的干擾。

3) 正確使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低溫環(huán)境中，只是在需要用酶才從冰箱中取出來(lái)。運(yùn)輸和臨時(shí)存放時(shí)需要將酶至于冰上。手拿酶管時(shí)不要接觸酶管下步含酶的部分，移酶時(shí)盡可能用長(zhǎng)TIP, 避免污染。用完后需要及時(shí)送回原處。注意：酶通常是zui后加。

4) 反應(yīng)體積需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，常?guī)的酶切一般要維持在10-50ul，酶切鑒定10-20ul就可以了。

5) 模板濃度問(wèn)題：濃度過(guò)高，溶液黏度過(guò)大，酶不能有效擴(kuò)散，酶切效果不會(huì)好。濃度過(guò)低，也會(huì)影響酶活性。

6) 注意模板用量和反應(yīng)體積的關(guān)系。對(duì)酶用量，模板用量，反應(yīng)體積等要素的確定需要的是時(shí)間和經(jīng)驗(yàn)的積累。

7) 酶切反應(yīng)的各個(gè)組分加完后，需要用TIP小心混勻幾次，short spin 一下就可以保溫了。一般不能使用振蕩器混勻。

8) 反應(yīng)溫度的選擇。一般反應(yīng)都用37度，但是 Sma I 的溫度是25度，37度時(shí)酶仍表現(xiàn)出活性，但是效率下降50%。部分從耐熱菌制備的酶需要在37度以上的溫度反應(yīng)，如Taq I的zui適溫度為65度，37度保溫，效率僅為前者的1/10。

9) 反應(yīng)時(shí)間的選擇。一般酶切鑒定30分鐘就可以了。要*酶切可以采用少量的酶長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)，或較高的酶量短時(shí)間處理都可以達(dá)到。在使用高酶量的時(shí)候需要注意甘油的zui終濃度不要超過(guò)5%，也就是說(shuō)10ul的體系，酶的用量不要超過(guò)1ul。

10) 是否和如何終止反應(yīng)?酶切鑒定之類的實(shí)驗(yàn)不需要特殊處理。滅活的手段：加入高濃度的EDTA;65度或80度熱處理20-30分鐘;部分從高溫菌純化出來(lái)的內(nèi)切酶由于zui適的反應(yīng)溫度比較高，熱處理滅活不一定*，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法純化;電泳回收也是實(shí)驗(yàn)室常用除酶的手段。

2.如果遇到酶切不動(dòng)或切不*，該怎么辦?

要回答這么問(wèn)題常常需要了解酶活性單位是如何確定，我們多次接到這樣的問(wèn)題：1個(gè)單位的酶能在60分鐘內(nèi)切1ug的DNA,為什么我們的DNA那么少切那么長(zhǎng)時(shí)間也不能切開(kāi)或切*? 從下面幾個(gè)因素去考慮：

1) 酶是否有活性：酶的活性單位通常是在60分鐘酶切1ug lambda DNA或特定線狀DNA所需要的酶量。鑒定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是別的公司的酶來(lái)判定。因?yàn)椴煌久缚赡苁菑牟煌到y(tǒng)中純化的，雖然識(shí)別位點(diǎn)相同，但是酶的特性可能是有差異的。鑒定酶必須使用使用說(shuō)明書上認(rèn)定的酶活確定的方式，通常需要用lambda DAN做模板來(lái)判定。同時(shí)如果酶對(duì)甲基化敏感，還需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于運(yùn)輸或分裝不當(dāng)導(dǎo)致酶活性下降，這種情況是很少發(fā)生。我們公司銷售的SibEnzyme公司的酶，在分裝前嚴(yán)格檢驗(yàn)過(guò)，不合格的東西(很少)都退回原廠，所以不合格的產(chǎn)品是不會(huì)送到用戶手頭的。

2) 模板性質(zhì)是否清楚：如果 DNA的類型變了所需要的酶量也不同。酶切效果與DNA的性質(zhì)(線狀，超螺旋狀)、位點(diǎn)數(shù)目、位點(diǎn)左右的序列、甲基化程度、純度等有很大的關(guān)系。對(duì)超螺旋狀DNA*酶切所需要的酶量要比線狀的高好幾倍(在我們的目錄上有部分酶是有標(biāo)注的)，同時(shí)需要提高酶的用量(10U/ug)和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等措施。還有一個(gè)問(wèn)題是有些時(shí)候DNA是從別人那里得到的，背景不清楚也造成困惑。

3) 模板純度是否夠：模板制備方式影響DNA的質(zhì)量，制備過(guò)程中使用到乙醇，氯仿，苯酚，SDS, EDTA等如果殘留在zui終的DNA模板中，都會(huì)不同程度影響酶的活性。Miniprep時(shí)如果用試劑盒抽提，需要的問(wèn)題污染是變性劑和乙醇;如果是手工制備的，氯仿，乙醇，苯酚及細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)都會(huì)不同程度的干擾酶活性。

4) 甲基化程度對(duì)酶的活性是否有影響：細(xì)菌中主要有Dcm和Dam兩種甲基化方式，在植物和動(dòng)物細(xì)胞中主要是CG位被甲基化。仔細(xì)看看使用的酶對(duì)甲基化的敏感情況，或許能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。

5) 反應(yīng)條件是否合適：對(duì)照說(shuō)明書，檢查使用的溫度是否正確，是否需要添加BSA, 是否使用正確的緩沖溶液。由于緩沖液中基本都含有DTT,反復(fù)凍融會(huì)使模板使DTT降解。注意有些研究人員將buffer長(zhǎng)時(shí)間放在4度或室溫，這是很不規(guī)范的行為。

6) 酶稀釋和添加方式是否正確：一般要求在zui后加酶，但是對(duì)同時(shí)做多個(gè)相同反應(yīng)的時(shí)候，zui后加酶有可能不很方便。通常是將緩沖、酶和適量的水配制成一個(gè)混合物，然后分裝，zui后加模板。需要提醒的是混合物(Master Mix)中由于沒(méi)有底物的存在，離子強(qiáng)度也不對(duì)，酶可能要受到損傷。這種提前混合的做法沒(méi)有問(wèn)題，只是動(dòng)作要快一些，沒(méi)有分裝前的Mix，要求放在冰里，盡快使用。

3.如何設(shè)定PCR引物的保護(hù)堿基?

如果您想直接對(duì)PCR產(chǎn)物酶切，同時(shí)想獲得理想的酶切效果，一般情況下需要在酶切位點(diǎn)序列5’端方向增加額外的保護(hù)堿基。保護(hù)堿基的數(shù)目隨酶的種類不同而不同，根據(jù)文獻(xiàn)資料匯總，一般保護(hù)堿基有3-4個(gè)就可以了。不提倡提供過(guò)多的保護(hù)堿基，因?yàn)樘嗟念~外堿基會(huì)增加PCR擴(kuò)增的難度，同時(shí)增加合成費(fèi)用。

4.如何對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行酶切?

Fermentas公司的研究表明，限制性內(nèi)切酶在 PCR擴(kuò)增體系中仍然有部分活性，可以通過(guò)稀釋(3倍以上)擴(kuò)增混合液，適當(dāng)提高酶量和反映時(shí)間，進(jìn)行酶切。我個(gè)人認(rèn)為需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析通常是為了或基因表型分析，由于Taq，Pfu等高溫聚合酶在酶切溫度(37度或更高)下，仍然保持一定的活性，高溫聚合酶所具有的聚合或無(wú)模板添A或外切修正的功能仍在一定的程度上表現(xiàn)出來(lái)，可能會(huì)影響到酶切產(chǎn)物末端的正確性。結(jié)果是要么裝不上去，要么裝上去切不下來(lái)，測(cè)序發(fā)現(xiàn)末端引物堿基少了。正確安全的做法是先通過(guò)瓊脂糖電泳回收產(chǎn)物，然后酶切，酶切可以適當(dāng)提高酶的用量。一般的做法是從50ulPCR反應(yīng)中回收的產(chǎn)物，溶解于45ul水中，加入酶，酶切后的產(chǎn)物通過(guò)從溶液中回收DNA的方式直接回收，不需要跑瓊脂糖電泳。