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氯化鈣制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
點(diǎn)擊次數(shù)：728 發(fā)布時(shí)間：2016-7-4
下面的簡(jiǎn)單方案是Clhen等(1972)所用方法的變通方案，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，這些細(xì)菌可使每微克螺旋質(zhì)粒dna產(chǎn)生5x106-2x107個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，這樣的轉(zhuǎn)化效率足以滿足所有在質(zhì)粒中進(jìn)行的常規(guī)克隆的需要。該方法*適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，并且比方案I快速，重復(fù)性更好。該法制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯存于-70℃，但保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使轉(zhuǎn)化效率在一定程度上受到影響。
1)從于37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(直徑2-3mm)，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約3小時(shí)(旋轉(zhuǎn)搖床，300轉(zhuǎn)/分)。為得到有效轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)不應(yīng)超過(guò)108細(xì)胞ml，可每隔20-30分種測(cè)量OD600值來(lái)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況。在菌株與菌株之間，OD600值和每毫升中活細(xì)胞數(shù)間的關(guān)系變化很大，因此有必要通過(guò)測(cè)量特定大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)增減物在生長(zhǎng)周期的不同時(shí)相的OD600值，并將各黧度的增減物鋪于無(wú)抗生素的LB瓊脂平皿以計(jì)算每一時(shí)相的活細(xì)胞數(shù)，從而使分光光度讀數(shù)得到標(biāo)化。
2)在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管(Falcon 2070)中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。切記：下述所有步驟均需無(wú)菌操作。
3)于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭)以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細(xì)胞。
4)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分釧以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
5)以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。我們發(fā)現(xiàn)將1mol/L CaCl2貯存液[用純水(Mille-Q級(jí)或與其相當(dāng)?shù)募?jí)別)配制]以10ml小份貯存于-20℃煞是方便。制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，取一小份融化，用純水稀釋至100mlk，用Nalgene濾器(0.45μm孔徑)過(guò)濾除菌，然后驟冷到0℃即可。對(duì)于大多數(shù)大腸肝菌菌株(除MC1061外)，在這一步采用TFB(見(jiàn)表1.3)代替氯化鈣可得到相同的或更好的結(jié)果。
6)于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細(xì)胞。
7)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
8)每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2[或TFB，見(jiàn)表1.3和步驟5)注]重懸每份細(xì)胞沉淀。此時(shí)，可將細(xì)胞分成小份，放于-70℃凍存[有關(guān)討論請(qǐng)參見(jiàn)53頁(yè)本節(jié)(二)步驟11)b.c)]。在這些條件下，盡管長(zhǎng)期保存后轉(zhuǎn)化效率會(huì)稍有下降，但細(xì)胞仍可保持處于感受態(tài)。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明細(xì)胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48小時(shí)，在貯存的zui初12-24小時(shí)內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率增加3-5倍，然后降低到初始水平。
9)用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加DNA(體積∞10μl,DNA∞50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。
10)將管放到預(yù)加溫到42℃的循環(huán)水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動(dòng)試管。
11)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2分鐘。
12)每管加800μlSOC培養(yǎng)基(見(jiàn)附錄A)。用水溶將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45分鐘細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。如果要求更高的轉(zhuǎn)化效率，在復(fù)蘇期中，應(yīng)溫和地?fù)u動(dòng)細(xì)胞(轉(zhuǎn)速不超過(guò)225轉(zhuǎn)/分)。
13)將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB瓊脂培養(yǎng)基上。如培養(yǎng)物體積太小(<10μl)?？稍偌尤鉁囵B(yǎng)基，用一無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕地將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂到瓊脂平板表面。如在一個(gè)90mm平板上鋪200μl以上的感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)離心濃縮細(xì)胞，然后用適量SOC輕輕重懸細(xì)胞。如用四環(huán)素抗性作為選擇標(biāo)記，全部的轉(zhuǎn)化混合物可以鋪在一個(gè)單獨(dú)的平皿上(或鋪在軟瓊脂中)。然而如選用氨芐青霉素抗性，則只能將一部分培養(yǎng)物(根據(jù)實(shí)驗(yàn)決定)鋪在單獨(dú)的平皿上。氨芐青霉素抗性功的增加與平皿上所加細(xì)菌數(shù)的增加并無(wú)線性比例關(guān)系，這可能是因?yàn)楸豢股貧⑺赖募?xì)胞可釋放生長(zhǎng)掏物質(zhì)的緣故。
14)將平板置于室溫直至液體被吸收。
15)倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12-16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。如檢查氨芐青霉素抗性，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪增板時(shí)密度較低(每個(gè)90mm平板不超過(guò)104菌落)，于37℃培養(yǎng)平板時(shí)不應(yīng)超過(guò)20小時(shí)。氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化可將β-內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周?chē)鷧^(qū)域中的抗生素。這樣，鋪平板時(shí)密度太高或培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)對(duì)氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落。在選擇培養(yǎng)基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能**之。