1實(shí)驗(yàn)原理

DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無性繁殖并表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。對于不同的受體細(xì)胞，往往采取不同的轉(zhuǎn)化戰(zhàn)略。

1.1 DNA重組分子的常用轉(zhuǎn)化方法

1.1.1 Ca 2 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)用CaCl2處理過的大腸桿菌能夠吸收l噬菌體DNA，此后不久，Cohen等人用此法實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，其整個(gè)操作程序?yàn)椋?)將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌置入0℃的CaCl2 低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2 使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài);2)此時(shí)加入DNA，Ca 2 又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上;3)經(jīng)短暫的42℃熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外在上述轉(zhuǎn)化過程中，Mg 2 的存在對DNA的穩(wěn)定性起很大的作用，MgCl2 與CaCl2 又對大腸桿菌某些菌株感受態(tài)細(xì)胞的建立具有*的協(xié)同效應(yīng)。1983年，Hanahan除了用CaCl2 和MgCl2 處理細(xì)胞外，還設(shè)計(jì)了一套用二甲基亞砜(DMSO)和二巰基蘇糖醇(DTT)進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生高頻感受態(tài)的程序，從而大大提高了大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率。目前，Ca 2 誘導(dǎo)法已成功地用于大腸桿菌、葡萄球菌以及其它一些革蘭氏陰性菌的轉(zhuǎn)化。

1.1.2 PEG介導(dǎo)的細(xì)菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

在高滲培養(yǎng)基中生長至對數(shù)生長期的細(xì)菌，用含有適量溶菌酶的等滲緩沖液處理，剝除其細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體，它喪失了一部分定位在膜上的DNase，有利于雙鏈環(huán)狀DNA分子的吸收。此時(shí)，再加入含有待轉(zhuǎn)化的DNA樣品和聚乙二醇的等滲溶液，均勻混合。通過離心除去聚乙二醇，將菌體涂布在特殊的固體培養(yǎng)基上，再生細(xì)胞壁，zui終得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。這種方法不僅適用于芽孢桿菌和鏈霉菌等革蘭氏陽性細(xì)菌，也對酵母菌、霉菌甚至植物等真核細(xì)胞有效。只是不同種屬的生物細(xì)胞，其原生質(zhì)體的制備與再生的方法不同。

1.1.3電穿孔驅(qū)動(dòng)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化

電穿孔(Electroporation)是一種電場介導(dǎo)的細(xì)胞膜可滲透化處理技術(shù)。受體細(xì)胞在電場脈沖的作用下，細(xì)胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接與裸露的細(xì)胞膜脂雙層結(jié)構(gòu)接觸，并引發(fā)吸收過程。具體操作程序因轉(zhuǎn)化細(xì)胞的種屬而異。對于大腸桿菌來說，大約50ml的細(xì)菌與DNA樣品混合后，置于裝有電極的槽內(nèi)，然后選用大約25微法拉第、2.5千伏和200歐姆的電場強(qiáng)度處理4.6毫秒，即可獲得理想的轉(zhuǎn)化效率。雖然電穿孔法轉(zhuǎn)化較大的重組質(zhì)粒(>100Kb)的轉(zhuǎn)化效率比小質(zhì)粒(～3Kb)低一千倍，但這比Ca2 誘導(dǎo)和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法理想，因?yàn)檫@兩種方法幾乎不能轉(zhuǎn)化大于100Kb的質(zhì)粒dna。對于幾乎所有的細(xì)菌均可找到一套與之匹配的電穿孔操作條件，因此電穿孔轉(zhuǎn)化方法有可能成為細(xì)菌轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)程序。

1.1.4接合轉(zhuǎn)化

接合(Conjugation)是指通過細(xì)菌細(xì)胞之間的直接接觸導(dǎo)致DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞的過程。這個(gè)過程是由結(jié)合型質(zhì)粒完成的，它通常具有促進(jìn)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞有效接觸的接合功能以及誘導(dǎo)DNA分子傳遞的轉(zhuǎn)移功能，兩者均由接合型質(zhì)粒上的有關(guān)基因編碼。在DNA重組中常用的絕大多數(shù)載體質(zhì)粒缺少接合功能區(qū)，因此不能直接通過細(xì)胞接合方法轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，然而如果在同一個(gè)細(xì)胞中存在著一個(gè)含有接合功能區(qū)域的輔助質(zhì)粒，則有些克隆載體質(zhì)粒便能有效地接合轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。因此，首先將具有接合功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞中，然后將這種供體細(xì)胞與難以用上述轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞進(jìn)行混合，促使兩者發(fā)生接合作用，zui終導(dǎo)致重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。

1.2轉(zhuǎn)化率及其影響因素

轉(zhuǎn)化率是轉(zhuǎn)化(包括感染)效率的評估指標(biāo)，通常有兩種形式表征轉(zhuǎn)化率，一是在待轉(zhuǎn)化DNA分子數(shù)大于受體細(xì)胞數(shù)的條件下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)之比，例如在標(biāo)準(zhǔn)條件下，利用Ca2 誘導(dǎo)法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA的zui大轉(zhuǎn)化率為10-3 ，即平均每一千個(gè)受體細(xì)胞中有一個(gè)細(xì)胞接納了質(zhì)粒DNA，如果假定處于感受態(tài)的受體細(xì)胞能100%地接納DNA分子，則這種轉(zhuǎn)化率直接反應(yīng)了受體細(xì)胞中感受態(tài)細(xì)胞的含量;轉(zhuǎn)化率的另一種表示形式是在受體細(xì)胞數(shù)相對于待轉(zhuǎn)化DNA分子數(shù)大大過量時(shí)，每微克DNA轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的克隆數(shù)。由于在一般規(guī)模的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，所觀測到的每個(gè)受體細(xì)胞只能接納一個(gè)DNA分子，因此上述轉(zhuǎn)化率的定義也可表征為每微克DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。例如，pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108 /mg DNA，其含義是每微克pUC18只有108 個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞，一微克pUC18中共有6.02×1017 /2,686×660=3.4×1011 個(gè)分子，也就是說，每3,400個(gè)pUC18分子中只有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞。如果能夠準(zhǔn)確確定轉(zhuǎn)化一微克pUC18所用的受體細(xì)胞的總數(shù)，則上述兩種轉(zhuǎn)化率是可以換算的。

1.2.1轉(zhuǎn)化率的用途

利用已知的轉(zhuǎn)化率和重組率參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)的規(guī)模。例如，某一連接系統(tǒng)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107 /mg DNA，經(jīng)體外切割與連接處理后的載體DNA或重組分子的轉(zhuǎn)化率比直接從細(xì)菌中制備的載體DNA低100倍，若載體DNA和重組DNA分子的轉(zhuǎn)化率差異忽略不計(jì)，則欲獲得104 個(gè)含有重組DNA分子的克隆，至少應(yīng)投入0.5mg的載體DNA，其計(jì)算方法如下：104 /20%×10-2×107 。按外源DNA片段與載體DNA分子數(shù)十比一的要求，即可推算出外源DNA片段的用量。如果轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液全部涂板篩選，理論上可形成5×104 個(gè)轉(zhuǎn)化克隆，若使每塊平板上平均含有1,000個(gè)克隆，則需涂布50塊平板。涂布過密會給后繼篩選帶來很大困難，涂布太稀，既浪費(fèi)又給篩選造成不必要的麻煩。

1.2.2轉(zhuǎn)化率的影響因素

轉(zhuǎn)化率的高低對于一般重組克隆實(shí)驗(yàn)關(guān)系不大，但在構(gòu)建基因文庫時(shí)，保持較高的轉(zhuǎn)化率至關(guān)重要。影響轉(zhuǎn)化率的因素很多，其中包括：

(1)載體DNA及重組DNA：

載體本身的性質(zhì)決定了轉(zhuǎn)化率的高低，不同的載體DNA轉(zhuǎn)化同一受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率明顯不同。載體分子的空間構(gòu)象對轉(zhuǎn)化率也有明顯影響，超螺旋結(jié)構(gòu)的載體質(zhì)粒往往具有較高的轉(zhuǎn)化率，經(jīng)體外酶切連接操作后的載體DNA或重組DNA由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比具有超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒低10-2 。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化率低。對于大于30kb的重組質(zhì)粒，即使采用電轉(zhuǎn)化的方法也很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

(2)受體細(xì)胞：

受體細(xì)胞一般要求是具有限制重組缺陷性，而且應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體DNA性質(zhì)相匹配，如pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，其轉(zhuǎn)化率不高于10 3 /mg DNA，但若轉(zhuǎn)化ED8767株，則可獲得106 /mg DNA的轉(zhuǎn)化率。

(3)轉(zhuǎn)化操作：

受體細(xì)胞的預(yù)處理或感受態(tài)細(xì)胞的制備對轉(zhuǎn)化率影響zui大。對于Ca2 誘導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化而言，菌齡、CaCl2 處理時(shí)間、感受態(tài)細(xì)胞的保存期以及熱脈沖時(shí)間均是很重要的因素，其中感受態(tài)細(xì)胞通常在12-24小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化率zui高，之后轉(zhuǎn)化率急劇下降。對于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化而言，再生率的高低直接影響轉(zhuǎn)化率，而原生質(zhì)體的再生率又受諸多因素的制約。在一次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，DNA分子數(shù)與受體細(xì)胞數(shù)的比例對轉(zhuǎn)化率也有影響，通常50-100ng的DNA對應(yīng)于108 個(gè)受體細(xì)胞或原生質(zhì)體，在此條件下，加大DNA量并不能線性提高轉(zhuǎn)化率，甚至反而使轉(zhuǎn)化率下降。而采用不同的轉(zhuǎn)化方法則將獲得不同的轉(zhuǎn)化率。

(4)試劑純度與器皿的潔凈度：

轉(zhuǎn)化過程中，所用的試劑(包括水)必須是高純度的。在Ca 2+ 法轉(zhuǎn)化中采用不同來源的CaCl2，轉(zhuǎn)化率差異非常大，實(shí)驗(yàn)中采用國產(chǎn)分析純的CaCl2 制備的感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率與進(jìn)口的同類型試劑相比要低10-2 左右。同樣對于保存細(xì)胞添加的抗凍劑甘油也應(yīng)采用高純度，在感受態(tài)細(xì)胞制備過程的所用器皿盡量酸洗后乙醇洗滌，超聲后用超純水淋洗。

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2實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

(1)用牙簽挑取少許大腸桿菌保藏液稀釋劃線于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16h。

(2)挑取單菌落接種于30ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)12～16h。

(3)按1%的接種量將大腸桿菌菌液接種于50mL LB培養(yǎng)基中。

(4)37℃搖床培養(yǎng)1.5～2.0h至OD600 為0.4左右，置冰水浴預(yù)冷。

(5)轉(zhuǎn)移至50ml預(yù)冷的離心管中，4℃恒溫，6 000轉(zhuǎn)/分離心10min。

(6)棄盡上清液，將菌體置于冰水浴中，用30ml預(yù)冷的100mmol/L CaCl2 -MgCl2 混合液輕輕混勻洗滌一次。

(7)4℃恒溫，6 000轉(zhuǎn)/分離心10min。

(8)棄盡上清液，將沉淀用1ml預(yù)冷的CaCl2 -甘油混合液重新輕輕懸浮。

(9)100mL/管分裝至預(yù)冷的Eppendorf管中(冰水浴中操作)，迅速置?80℃冰箱冷凍保藏。

2.2 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

(1)從-80℃冰箱取一管大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，手心融化，迅速置于冰水浴中。

(2)加入5ml DNA或10ml連接液，輕輕混勻，冰水浴中放置30min。

(3)取出混勻后42℃水浴脈沖2min。

(4)快速轉(zhuǎn)移至冰水浴中放置1～2min，加入900ml LB培養(yǎng)基，37℃搖床復(fù)蘇培養(yǎng)1～1.5h;

(5)吸取100ml轉(zhuǎn)化液涂布于適當(dāng)?shù)腖B固體培養(yǎng)基上;

(6)37℃倒置培養(yǎng)12～16h，挑選出單菌落劃線擴(kuò)增。