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回收.連接.轉化.克隆.測序
點擊次數：1058 發(fā)布時間：2016-7-18
目標片斷回收后立即與pGEM-T載體做連接反應。反應體系：2X連接buffer 5μl，回收產物 3μl，T載體 1μl，T4連接酶 1μl，共10μl;混勻，4℃放置16小時以上
轉化:
1、從-70℃冰箱中取40μl感受態(tài)細胞懸液,冰上解凍。
2、 加入連接產物1-2μl (含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕彈勻,冰上放置25分鐘后。(38μl ddH2O+20μl KCM+50μl感受態(tài))。
3、42℃水浴中熱擊45秒,熱擊后迅速置于冰上冷卻2分鐘。
4、向管中加入0.6ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時,使細菌恢復正常生長狀態(tài),并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、在加有氨芐的瓊脂糖平板上預加40μl的X-gal和4μl的IPTG，推棒涂勻，放置10min讓其充分吸收
6、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液*被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時。
7. 培養(yǎng)12小時后，挑選圓潤的菌落轉入另一個預加有40μl X-gal和4μl IPTG并劃分不同區(qū)域的平板上，37℃培養(yǎng)8小時。
陽性克隆的鑒定:
做菌落PCR挑選陽性克隆:在反應管中加入8μl無菌水，挑選單個菌落入管中，加10μl礦物油封住液面，95℃反應5min。結束后在每管中加入除模板外的其他反應體系，用量與反應條件與擴增相同。挑選電泳結果好的測序。
注意事項
同時做兩個對照: 對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。 對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
1.將感受態(tài)細胞加入要轉化的東東(一般原則是轉化物體積不超過感受態(tài)細胞體積的十分之一)。冰上置半小時。
2.熱休克：42度，時間30秒至120秒都可以。一般書上都是90秒。
3.復蘇：熱休克后加入4倍體積的無抗生素培養(yǎng)基SOC(如果嫌麻煩，LB也可)，37度搖一小時。轉速低于220轉/分鐘。
4.涂板：4000轉離心2-3分鐘，多余上清不要，留約200UL將菌液混勻，推平板，直到菌液基本涂干。37度孵箱放12-16小時。