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如何用S1核酸酶對RNA作圖
點擊次數(shù)：1189 發(fā)布時間：2016-8-8
用s1核酸酶對RNA作圖
三種不同的核酸酶——S1核酸酶、rna酶、外切核酸酶Ⅶ被用來進行RNA定量，確定內(nèi)含子位置，以及用來鑒定在克隆的DNA模板上的mRNA 5′端和3′端的位置。當檢測RNA被雜交到DNA模板上時，用核酸酶S1進行保護試驗的分析;當檢測RNA被雜交到來自DNA模板的RNA上時用RNA酶。外切核酸酶Ⅶ有更專一的用途——對短的內(nèi)含子作圖并解決S1核酸酶保護試驗中出現(xiàn)的異常情況。
這三種酶的使用方法是Berk和Sharp(1977)提出的經(jīng)典S1核酸酶保護試驗技術(shù)的改良。含有目的mRNA的RNA樣品與互補的DNA或RNA探針在利于形成雜合體的條件下溫育。在反應(yīng)的末期，一種酶用來降解未雜合的單鏈RNA和DNA。剩下的DNA-RNA或RNA-RNA雜合體用凝膠電泳分離，接著用自顯影或southern雜交來觀察。當探針的摩爾數(shù)在雜交反應(yīng)中過量時，信號的強度和樣品中的目的mRNA的濃度成正比。用過量探針與一系列定量靶序列雜交作出標準曲線，從而準確估算樣品濃度。S1核酸酶保護試驗的zui初模式中一個主要的問題是用雙鏈DNA作為探針。為防止探針DNA在雜交一步重新結(jié)合，理想的情況是建立有利于形成RNA-DNA雜合體遠甚于形成DNA-DNA雜合體的反應(yīng)條件，但并不總是可行。因為DNA-RNA雜合體比DNA-DNA雜合體略微穩(wěn)定，復(fù)性條件一般是含80%甲酰胺、溫度高于雙鏈DNA熔點的計算值。然而，在這種條件下，雜交速度降低約10倍，而且DNA-RNA雜體產(chǎn)物的穩(wěn)定性也不確定。使用單鏈探針則可以解決這些問題。復(fù)性可以在正常的雜交條件下進行，因為沒有互補的單鏈和靶RNA競爭探針。但是當Berk和Sharp進行研究時，還沒有可靠的方式去除其互補部分的單鏈DNA。鏈分離凝膠電泳是那時惟一可行的方式，但它始終是一種技巧性很強、難于掌握的技術(shù)。只有70%的DNA片段可以得到分離，而且即使在相當成功的條件下，樣品中也不可避免的污染互補DNA單鏈。直到20世紀80年代后期，通過制造有高度特異活性的標記單鏈DNA或RNA探針才解決了這一問題。
S1核酸酶保護試驗中使用的探針通常是由雙鏈DNA兩條鏈分離得到的，已知極性且特異性高?；蛘吒毡榈兀瑥念^合成與雙鏈DNA模板的一條鏈互補的RNA或與單鏈模板互補的DNA。
鏈分離的探針通過同時或依次使用兩種Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶預(yù)處理，產(chǎn)生在5′端和3′端各有一段突出的合適大小的DNA片段(通常100~500個核苷酸)。因此該片段的一條鏈zui多可以比另一條鏈長8個核苷酸。在變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳已足夠分離這種差異的兩條鏈。在電泳前或電泳后，目的單鏈的5′端被去磷酸化并從[γ-32P]得到標記的磷酸基團，從而在體外被標記，T4噬菌體多核苷酸激酶催化這一反應(yīng)。
從頭合成探針法用來體外產(chǎn)生末端標記或均勻標記的DNA探針。末端標記的探針通過將寡核苷酸引物的5′端磷酸化而得到。均勻標記的探針通過放射標記的核苷酸引入正在合成的DNA單鏈得到。在兩種情況下，通過一種可識別新合成的雙鏈DNA上特異位點的限制性酶酶切，分離新合成的DNA鏈和模板。接下來可以用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離放射性標記的探針和線性化的單鏈DNA。
當一種引物濃度是另一種的20~200倍時，pcr反應(yīng)嚴重偏聽偏向于合成只和DNA其中一條鏈作用的放射性標記探針。當PCR反應(yīng)剛開始的幾個循環(huán)里，雙鏈DNA以普遍的指數(shù)形式合成。然而，當一種引物的濃度受*，反應(yīng)以算術(shù)速度產(chǎn)生單鏈DNA。到反應(yīng)結(jié)束時，DNA某一條鏈的濃度比另一條多3~5倍。
通過雙鏈DNA模板和僅一種引物的熱循環(huán)反應(yīng)合成*只含DNA一條鏈的放射性標記的探針。經(jīng)過40個循環(huán)，雙鏈模板DNA(20 μg)產(chǎn)生約200 μg的單鏈探針。探針的長度可以通過在模板DNA探針結(jié)全位點的下游選取酶切位點加以限定。
通過轉(zhuǎn)錄連在噬菌體啟動子上的線形雙鏈DNA模板，可以產(chǎn)生均勻標記的RNA探針，即核糖核酸探針。通過在重組質(zhì)?？寺〉腄AN序列中或其下游選取酶切位點酶切可以得到DNA模板，也可用PCR擴增模板。線形化的模板在[γ-32P]NTP存在的條件下由合適的噬菌體來源的依賴DNA的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生長度為從模板DNA片段啟動子的起始位點到其終點的標記的RNA。啟動子和DNA序列按照一定的方向排列，從而使得到的核糖核酸探針與待分析的mRNA是反義(互補)。嚴謹?shù)牡⒎潜仨毜暮罄m(xù)工作是用變性瓊脂糖凝膠電泳純化RNA探針。純化可以用微型凝膠模子里配制的5%聚丙烯酰胺凝膠-8 mol/l尿素體系以及微型蛋白凝膠裝置中簡易快速的執(zhí)行。
即使使用單鏈探針，用S1核酸酶分析真核RNA結(jié)構(gòu)還是會有假象。例如，DNA:RNA雜合雙鏈中微小的不配對就會對S1核酸酶有抗性。相反地，富含rU:dA序列的配對的雜合雙鏈區(qū)容易受到酶切。一條單鏈DNA分子如果同時和兩條不同的RNA分子雜交，則可以不被核酸酶作用。zui后一點，S1核酸酶不能有效地切割與RNA突出環(huán)相對的一段DNA。大多數(shù)這些問題可以用改變S1核酸酶濃度、采用不同酶切濃度、使用不同的核酸酶(如綠豆核酸酶)、使用幾種核酸酶組合(如RNase H和S1核酸酶)來解決。但是注意的是，用S1核酸酶作用于兩種核酸并不一定能反映出差異，而不被消化的兩條核酸也不一定相同。用S1核酸酶繪制mRNA 5′端和3′端圖譜，很得要的一點是要用獨立的技術(shù)如引物延伸來加以驗證。
在許多作圖實驗中，綠豆核酸酶可以替代S1核酸酶。當和DNA探針一起使用時，完成單鏈區(qū)*酶切所需的綠豆核酸酶遠少于S1核酸酶。例如，酶切對應(yīng)于人低密度脂蛋白受體的過量的單鏈DNA探針需要S1核酸酶達到1000 單位/ ml可完成*酶切，而綠豆核酸酶只需要10 單位/ ml就可達到相同的結(jié)果。綠豆核酸酶的生個缺點是在單位堿基上的用量比S1核酸酶多20倍。在下述實驗方案中，綠豆核酸酶可以在第22步替代S1核酸酶。綠豆核酸酶消化作用的緩沖液：10 mmol/l醋酸鈉(pH 4.6)-50 mmol/l NaCl-1 mmol/l ZnCl-1 mmol/l β-硫基乙醇-0.001%(V/V)Triton X-100。