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DTT特性與保存及其在蛋白純化和保存中的作用
點(diǎn)擊次數(shù)：5659 發(fā)布時(shí)間：2016-8-30
DTT( 二硫蘇糖醇)是實(shí)驗(yàn)室常用的還原試劑，常被用于蛋白質(zhì)保存以及蛋白二硫鍵的還原。DTT的入特點(diǎn)是極易被氧化，穩(wěn)定性較差，一般DTT常保存于-20度中可以長達(dá)數(shù)年。
DTT是一種很強(qiáng)的還原劑，其還原性很大程度上是由于其氧化狀態(tài)六元環(huán)(含二硫鍵)的構(gòu)象穩(wěn)定性。它的氧化還原電勢在pH為7時(shí)為-0.33伏。
DTT特點(diǎn)與DDT的保存
DTT是一種常用還原劑，有抗氧化作用，進(jìn)口分裝。DTT和巰基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時(shí)，兩者效果相近。但DTT價(jià)格略高一些。DTT粉末的一般保存條件：-20℃保存。1M DTT溶液可以在-20℃保存2年以上。
由于容易被空氣氧化，因此DTT的穩(wěn)定性較差;但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命。由于質(zhì)子化的硫的親核性較低，隨著pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之降低;而Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl(TCEP鹽酸鹽)可以作為低pH值條件下DTT的替代品，而且也比DTT更為穩(wěn)定。
應(yīng)用：
DTT的用途之一是作為巰基化DNA的還原劑和去保護(hù)劑。巰基化DNA末端硫原子在溶液中趨向于形成二聚體，特別是在存在氧氣的情況下。這種二聚化大大降低了一些偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(如DNA在生物感應(yīng)器中的固定)的效率;而在DNA溶液中加入DTT，反應(yīng)一段時(shí)間后除去，就可以降低DNA的二聚化。
DTT也常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。但DTT往往無法還原包埋于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部(溶劑不可及)的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先將蛋白質(zhì)變性(高溫加熱或加入變性劑，如6M 鹽酸胍、8M 尿素或1% SDS)。反之，根據(jù)DTT存在情況下，二硫鍵還原速度的不同，可以判斷其包埋程度的深淺。
DTT在蛋白純化和保存中的作用
我們知道Cys存在與許多蛋白中，且其中的-SH常作為活性中心發(fā)揮作用，或者，兩個(gè)-SH連接成二硫鍵，是維持蛋白質(zhì)構(gòu)象重要橋梁。-SH具有很強(qiáng)的還原性，溶液被溶液中的溶解氧或其它氧化物氧化，從使蛋白失去活性。所以，在蛋白純化和保存時(shí)，在溶液中加入一定量的DTT，以免蛋白-SH被氧化而失活。但這里就有一個(gè)矛盾，DTT該加多少量，以使-SH保持還原狀態(tài)，而使二硫鍵免遭還原?除了上述作用，DTT還有哪些方面可以起到作用?
我也曾聽一高人說起過，以摩爾數(shù)計(jì)算，5-10倍的量來保護(hù)-SH。如果蛋白報(bào)存buffer中含有15%左右的甘油，對蛋白具有很好的穩(wěn)定作用。補(bǔ)充一點(diǎn)：如果dtt和蛋白摩爾比例比例增大到1：100，DTT就能破壞2硫鍵了，這時(shí)對應(yīng)的濃度一般在10mM左右，這個(gè)一般在做還原肽圖的時(shí)候用到。
不過有些分子內(nèi)的二硫鍵由于空間位阻的作用，還原劑的量增加到很大也不能破壞。這時(shí)可能要配合尿素等變性劑才能*打斷二硫鍵(如包涵體變性)
DTT在離子狀態(tài)才有作用，在pH7-9.5的時(shí)候作用zui強(qiáng)，pH降到3以下幾無電離，因此可以通過降低pH至3以下來終止DTT作現(xiàn)在才知道DTT作用還受到pH的影響。提到尿素變性，要是蛋白存在分子間或分子內(nèi)二硫鍵，即使具有高濃度的尿素或鹽酸胍，而沒有DTT等還原劑，那是否也不能使蛋白*變性(斷裂二硫鍵)?
我記得有篇“從純化到星辰”文章中提到“萬金油”配方是這樣的:
50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol
DTT斷裂二硫鍵需要什么的條件?蛋白的二硫鍵斷裂后，形態(tài)、功能等發(fā)生怎樣的改變?
我不是專門搞生化的。只是知道點(diǎn)皮毛而已，就我了解的而言，western blot要得以進(jìn)行，特別是抗體要和目的蛋白結(jié)合，一方面要使打開蛋白質(zhì)的SS鍵，因?yàn)槿绻鸖S鍵不打開，很有可能抗體不能很好的識別特定的位點(diǎn)，就不能結(jié)合上去;另一方面還要用SDS-PAGE消除蛋白質(zhì)分子內(nèi)的各種非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)所帶電荷和其分子量成正比，這樣才能使蛋白質(zhì)分離出來。
DTT在電泳中還有一個(gè)作用。過量DTT能打開多聚體內(nèi)的二硫鍵，使呈各個(gè)單體狀態(tài)，而在loading中去除DTT后，多聚體仍然保持原狀態(tài)。因此兩者對比可以分辨該蛋白是否含有多聚體形式。
結(jié)合我的實(shí)驗(yàn)，我做的是有關(guān)纖維素酶基因的克隆與表達(dá)。應(yīng)用的是家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。
攜帶有纖維素酶基因片段的重組病毒構(gòu)建好以后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞所獲得的達(dá)到一定滴度的重組病毒從皮下注射到家蠶體內(nèi)。
家蠶血淋巴中是否能表達(dá)纖維素酶?這是我目前所研究的重點(diǎn)。難點(diǎn)以及疑惑：家蠶血淋巴在空氣中容易被氧化，雖然低溫下可保持短時(shí)間內(nèi)不被黑化(即氧化)，但測酶活的時(shí)候需要經(jīng)過50度反應(yīng)30分鐘這一步，所以我*次做的時(shí)候由于沒添加巰基乙醇或者DTT，所以溶液變黑了。